小鼠Nanog基因负调控作用的研究

发布时间：2017-12-15 14:04

  本文关键词：小鼠Nanog基因负调控作用的研究

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【摘要】：胚胎干细胞来源于哺乳动物胚胎的内细胞团,具有在体外培养中保持无限自我更新并维持其多能性的能力。鉴于干细胞这种多向分化潜能,被期望用于再生医学领域。然而干细胞干性维持和定向分化的精确调控机制尚不清楚,导致干细胞的临床应用缺乏系统的理论指导,难以深入。因此研究干细胞干性维持和定向分化的调控机理具有重要的意义。Nanog蛋白是一个含有同源异形结构域的转录因子,对胚胎干细胞命运决定具有核心调控作用。解除Naong抑制因素可以提高诱导多能性干细胞(iPS)的诱导效率,并为干细胞定向分化提供理论基础。因而研究Nanog基因负调控作用对于提高iPS诱导效率具有重要的意义。本论文采用实时定量PCR、Western blot、免疫荧光染色、基因表达谱芯片、小RNA测序等方法检测基因表达水平变化;利用双荧光素酶报告实验和染色质免疫共沉淀(ChIP)研究基因调控关系;借助体内生物素化系统和Co-IP检测技术研究Foxc1蛋白相互作用,从转录水平和转录后水平研究了Naong基因的负调控作用,主要研究结果如下:1.发现Nanog基因在F9细胞分化过程中下调。分化的F9细胞表现为多能性因子Nanog下调、分化基因Foxc1上调、碱性磷酸酶水平降低。相关分化基因在NIH/3T3中高表达,而在F9细胞和胚胎干细胞中低表达,多能性基因如Nanog表达趋势相反。2.揭示了Foxc1抑制Nanog表达的机理。构建Foxc1真核表达载体p3×Flag-Foxc1,实时定量PCR和Western blot验证载体可以正确表达。实验发现Foxc1抑制Naong基因的mRNA和蛋白表达水平,但不影响多能性基因Oct4的表达。并且有效干涉Foxc1后得到一致性的实验结果。揭示Foxc1对Nanog的作用不是由于胚胎干细胞多能性的降低产生的。构建Nanog启动子报告载体,进行双荧光素酶报告实验,结果指出Foxc1可以在启动子水平调控Nanog的表达,从而影响Nanog mRNA和蛋白的表达。截掉-3128/-2224 bp的Nanog启动子活性回升1.5倍。说明在此启动子区域存在负调控元件。染色质免疫共沉淀实验证明了Foxc1可以结合在Nanog启动子-3128/-2224 bp区,从而发挥调控Naong的基因表达的作用。3.蛋白组学技术鉴定Foxc1相互作用蛋白。构建Foxc1生物素化载体pBiotin-Foxc1,并构建稳转pBiotin-Foxc1的细胞系293T-Biotin-Foxc1和对照细胞系293T-Biotin,然后亲和纯化富集Foxc1的互作蛋白,进行质谱鉴定。发现相关互作蛋白有p53、Carm1、Ehmt2、Wdr77、Gata6、Hdac2、Nedd8等。其中p53、Gata6、Carm1与Nanog调控关系已有报道,这就为Foxc1协同互作蛋白调控Nanog表达提供了有利的研究基础。此外,组蛋白修饰相关蛋白如Ehmt2、Hdac2也被检测到,这说明Foxc1对Nanog的调控作用机理,可能涉及表观调控。4.发现Foxc1协同互作蛋白Tet3抑制Nanog基因的表达。F9中过表达Foxc1可以促进Tet3的表达,干涉Foxc1后,Tet3表达水平下降。构建Tet3真核表达载体进行同样实验后,结果证实二者相互促进,并且Tet3抑制Naong的表达。Co-IP证明二者可以相互作用。这就说明Foxc1协同互作蛋白Tet3抑制Nanog基因的表达。5.抑制FGF-ERK通路促进Nanog基因的表达。建立“ground state”状态的小鼠胚胎干细胞,其中最重要的因素之一就是抑制FGF-ERK信号。我们用小分子PD0325901抑制FGF-ERK信号通路,然后分析整体mRNA表达水平的变化。发现抑制FGF-ERK信号使分化基因下调和多能性基因上调,并且促进典型胚胎干细胞克隆样的形态;多能性基因Nanog从低水平向高水平表达转变,降低了Nanog表达的异质性。抑制FGF-ERK通路后,利用小RNA测序分析整体microRNA(miRNA)的变化,发现大量差异miRNAs呈现下调趋势,但部分有利于iPS诱导的miRNAs上调。同时绘制了miRNAs维持胚胎干细胞多能性的调控图。6.FGF-ERK信号通路相关的miRNAs调节Nanog的表达。实验结果表明miR-296抑制Nanog基因的表达,而抑制FGF-ERK通路后,miR-296被抑制。多能性基因Nanog表达水平被改变,从而促进小鼠胚胎干细胞的均一性。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78

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本文编号：1292203