海南粗榧内生真菌CH1307主要次级代谢产物的研究

发布时间：2017-12-15 18:08

  本文关键词：海南粗榧内生真菌CH1307主要次级代谢产物的研究

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【摘要】：药用植物是天然药物筛选的最主要途径,但自从证实了某些内生真菌可产生与宿主相同或相似的生理活性成分以来,通过培养药用植物内生真菌以获得具有药用活性成分已成为当前研究热点。目前,海南粗榧(Cephalotaxus hainanensis Li.)是生产抗血癌药物高三尖杉酯碱(HHT)的原料,但由于该树种资源极其有限,很难满足日益增长的临床需要。因此,筛选海南粗榧内生真菌以获得具有类似HHT或其他活性成分尤为重要。本研究以前期从海南儋州热带植物园一株海南粗榧的茎干韧皮部分离的内生真菌CH1307 (Alternaria tenuissima)为研究对象。前期研究结果表明,该菌株有生产HHT的能力,但经长期保藏和多次传代培养后发现采用动态摇瓶的发酵方式,其合成HHT的能力不稳定,且该菌株在形态上存在多变性。因此,本研究首先确认了该菌株是否仍然具备合成HHT的能力；其次,对该菌株进一步分离纯化和鉴定,探讨经多次传代后菌株是否发生变化；最后,采用大米固态发酵的方式,研究该菌株次级代谢产物粗提物的生理活性,并对其粗提物分离、纯化,对获得的单体化合物进行结构鉴定及抗癌活性评价。主要研究结果如下：(1)动态摇瓶发酵内生真菌CH1307次级代谢产物中HHT的检测以动态摇瓶方式发酵内生真菌CH1307,获得发酵液40 L后提取生物碱粗提物,采用沉淀反应定性检测生物碱。后经超高效液相色谱质谱联用技术(UPLC-MS/MS)及核磁共振波谱(NMR)证实了内生真菌CH1307仍然具备一定的合成HHT能力,产量为81.2∥g/L。(2)内生真菌CH1307进一步分离纯化及分子鉴定对内生真菌CH1307进一步分离,观察到其菌落形态存在多变性,故依据菌落直径及形状、气生菌丝形态及高度、色素产生与否及培养皿正反面颜色等几个方面将CH1307进一步细分为五个形态型,分别命名为CH1307a、CH1307b、CH1307c、 CH1307d和CH1307e。经显微观察发现这五个形态型的菌丝形态具有一定的相似性,但仅观察到CH1307c有孢子。此外,对五个形态型菌株的rDNA-ITS区段比对分析发现,它们的ITS序列相同。基于rDNA-ITS基因片段及形态学特征,仅能将CH1307的五个形态型菌株划分为链格孢属(Alternaria sp.)菌株。(3)大米固态发酵菌株CH1307c次级代谢产物粗提物的化合物种类及生理活性以大米固态发酵方式对CH1307c做进一步研究。试管定性反应结果表明,其次级代谢产物的化合物类型丰富,含有酚类、生物碱、黄酮类、皂苷类、甾体类、蒽醌类及挥发油类等多种物质。其次级代谢产物粗提物对七个指示菌(Escherichia coli, Staphylococcu aureus, Bacillus subtilis, Streptococcus agalactiae, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium oxysporum f.sp. Cubense)均无抑制作用；此外,此粗提物对细胞株K562未表现出抑制活性,但对两种急性白血病细胞株表现出强细胞毒活性(NB4的IC50.28μg/mL,HL60的IC50=35μg/mL)。(4)大米固态发酵菌株CH1307c次级代谢产物的结构鉴定及活性评价以大米固态方式对菌株CH1307c进行大批发酵,获得其乙酸乙酯粗提物浸膏200.4g,采用正相硅胶柱层析、薄层层析(TLC)、半制备液相色谱及重结晶等方法进行分离、纯化,并基于NMR对8个单体化合物进行结构鉴定。它们分别是：Pestalotiopin A(1)、β-谷甾醇(2)、链格孢酚5-O-硫酸盐(3)、链格孢酚甲醚(4)、7-羟基-6-甲氧基香豆素(5)、啤酒甾醇(6)、Oblongolide V(7),3-甲氧苯酚(8)。此外,这八个化合物对白血病细胞株K562和NB4未表现出抑制活性。
【学位授予单位】：海南大学
【学位级别】：博士后
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S791;Q936

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

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本文编号：1292913