DNA复制起始过程中MCM复合物构象变化的机制研究

发布时间：2017-12-15 22:15

  本文关键词：DNA复制起始过程中MCM复合物构象变化的机制研究

  更多相关文章： DNA复制 DNA解旋酶 MCM复合物 双六聚体构象 甲基化修饰

【摘要】：对于所有物种来说,DNA复制都是最基本最具决定性的生物过程之一。生物性状的继承和物种的繁衍都依赖于储存在DNA上的遗传信息的精确拷贝。为了确保遗传信息的准确传递,DNA复制过程需要受到严格的时空控制,尤其在复制起始阶段。该阶段的控制主要通过复制解旋酶的装载和激活得以实现。真核生物细胞在G1期时,复制解旋酶核心MCM以无活性的双六聚体构象装载于复制起点的双链DNA上。在S期时MCM被激活,从而启动DNA双向复制,但具体激活机制仍然未知。本研究针对真核DNA复制这一关键科学问题,采用了不同于此前体外重建的新策略,以MCM的构象变化为切入点,对复制解旋酶激活的分子机制进行了较为深入的探索。本研究首先探究了酿酒酵母体内Mcm2-7双六聚体的构象变化及其机制。通过建立直接检测和纯化内源双六聚体Mcm2-7的方法,首次观察到内源双六聚体Mcm2-7于G1期装配到染色质上,并且在s期发生分离的现象。同时检测到Mcm10蛋白能够与染色质组分中的双六聚体Mcm2-7被共同纯化。这种Mcm10与非活性构象解旋酶之间特异的相互作用暗示着Mcm10有可能参与了解旋酶的分离激活过程。为此,通过建立的体内双六聚体Mcm2-7分离分析技术,本研究结果证明双六聚体Mcm2-7的分离是s期复制解旋酶激活、启动复制过程中的一个新的必需步骤,并且当Mcm10蛋白被诱导降解后,Mcm2-7双六聚体无法分离。为了进一步揭示Mcm10作用机制,本研究详细分析了Mcm10与Mcm2-7相互作用的结构域,证明Mcm 10的C端能直接与Mcm2-7结合并且是介导该相互作用的主要结构域。C端敲除突变体(mcmlOAC)表现出显著的复制以及生长缺陷,而通过GFP-GBP融合技术重建Mcm10突变体与Mcm2-7的相互作用则可以回补上述缺陷。这些结果证实mcm10△C在复制中的缺陷是由Mcm10-MCM相互作用被破坏而造成的。更重要的是,mcm10AC突变体中双六聚体Mcm2-7在s期的分离明显延迟,从而将Mcm10的一个必需功能更精确地定位到双六聚体解离这一变构步骤。基于以上结果,本研究提出了一个Mcm10-MCM动态相互作用介导的真核复制解旋酶Mcm2-7双六聚体分离变构激活模型。此外,本研究还以极端嗜热古菌冰岛硫化叶菌MCM (sisMCM)为模式,对这类保守的真核生物简化版的关键复制解旋酶进行了生化分析。本实验室前期报道了古菌甲基转移酶aKMT4。有意思的是,重组sisMCM到体外也能被aKMT4甲基化。通过质谱分析,鉴定到三簇赖氨酸残基位点的单甲基化修饰,并且这些位点的甲基化修饰也存在于内源sisMCM中。在体外DNA解旋酶反应温度(65℃)下,甲基化修饰使sisMCM解旋酶活性增强了约50%。当对sisMCM先进行了高温(80℃C,硫化叶菌最适生长温度)预处理,甲基化修饰后sisMCM的解旋酶活性增强了约100%。此外,sisMCM解旋酶在80℃C的半衰期从2.8小时延长至7.2小时。sisMCM的模拟甲基化突变体表现出与甲基化修饰sisMCM一致的热稳定解旋酶活性。三簇被甲基化修饰的赖氨酸残基位点均位于sisMCM六聚体表面,由此推测甲基化修饰可能通过改变疏水性和表面电荷来调节sisMCM分子内和分子间的相互作用。上述结果说明古菌可能通过甲基化修饰来提高自身蛋白的动力学稳定性,从而增强它们对极端高温环境的适应性。DNA复制解旋酶MCM活性的调节和控制机制是目前DNA复制研究领域的重点核心课题。本研究的结果为解决这一几十年来悬而未决的经典难题提供了重要线索,将有助于推动真核DNA复制起始过程的完整模型的解析,从而增进人们对细胞生长增殖规律的认识。
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q523

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