微生物蛋白酰化修饰与合成代谢调控

发布时间：2017-12-15 23:11

  本文关键词：微生物蛋白酰化修饰与合成代谢调控

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【摘要】：蛋白赖氨酸酰基化修饰是一种动态可逆的翻译后修饰,通过调控蛋白的活性,定位,以及蛋白间的相互作用来影响诸多生物过程。蛋白酰化修饰构建了酰基-CoA代谢与胞内信号通路网络的关联性。酰化修饰水平与细胞内酰基-CoA的浓度与种类密切相关,高浓度酰基-CoA的积累能通过酶催化与非酶催化的方式影响酰化修饰的程度,从而影响细胞内多样的生理功能。此外,酰基-CoA可以作为合成代谢产物的前体,用于不同类型产物的生物合成中。本文以多种微生物模型为研究对象,系统研究了蛋白酰化修饰的发生及动态变化对合成代谢途径中关键酶的反馈调控作用,同时也从代谢物影响酰化修饰的角度,鉴定了一种受到氨基酸变构调控的蛋白乙酰转移酶系统。研究由以下四部分组成:(1)红霉糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)蛋白丙二酰化定性及定量研究:我们结合了高灵敏度的质谱技术以及高亲和性的赖氨酸丙二酰化抗体富集技术,对红霉糖多孢菌中蛋白赖氨酸丙二酰化修饰底物进行了鉴定。这是首次在原核生物中进行蛋白丙二酰化修饰组学的报道。此外,我们结合生物信息学工具,进行了修饰底物的功能定位,位点分析,相互作用分析等。并通过点突变分析模拟了赖氨酸丙二酰化位点对代谢酶的调控作用。此后,我们针对对数生长期及平台期S.erythraea菌的蛋白丙二酰化修饰进行定量分析,揭示了不同生长周期蛋白丙二酰化修饰的动态变化。在此基础上,我们发现丙二酸盐添加情况下,红霉糖多孢菌和天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)体内赖氨酸丙二酰化修饰水平的差异。证明了细胞内丙二酰-CoA的浓度影响了蛋白丙二酰化的修饰水平,从而为蛋白酰化修饰与微生物合成代谢途径关联性的研究打下了基础。(2)蛋白酰基化反馈调控机制对红霉素合成的影响:通过定量蛋白酰化组学分析,我们发现S.erytraea菌的野生WT型相对于高产E3菌而言,在蛋白乙酰化修饰整体水平没有差异的情况下,丙酰化修饰整体水平显著提高。我们进一步通过酶活分析,探究了蛋白丙酰化修饰对丙酰-CoA合成通路中丙二酸半醛脱氢酶(mmsA2)的抑制作用,揭示了在产物合成过程中,存在酰化修饰对合成途径代谢酶的反馈调控。此后,我们在工业生产红霉素的过程中,通过对不同浓度正丙醇添加后的红霉素产量测定及丙酰化底物的分析,证明了蛋白丙酰化修饰能够通过抑制丙醛脱氢酶以及SAM合成酶的活性,降低了红霉素的产量。最后,我们在S.erythraea高产菌中过表达去酰基化酶,缓解了高正丙醇添加情况下的蛋白丙酰化抑制作用。我们的研究首次建立了蛋白酰化修饰与微生物产物合成途径的关联性,扩展了对蛋白酰化修饰调控广泛性的认知。(3)蛋白酰基化调控机制存在于多种以酰基-CoA为前体的产物合成中:我们首先证明了蛋白酰化修饰反馈抑制效应存在于以丙二酰-CoA为前体的十一烷基灵菌红素的生物合成中,接着又证明了蛋白酰化修饰影响了能源类物质丁醇的生物合成。在此基础上,我们进一步探讨蛋白酰化反馈调控效应对以底盘大肠杆菌(Eschericia coli)细胞为合成工厂的人工构建型的丙二酰-CoA依赖性赤松素合成途径的影响。证明了蛋白丙二酰化修饰能够抑制4-对香豆酸连接酶(4CL)以及芪合成酶(STS)的活性,从而抑制赤松素的产量。最后,我们通过对丙二酰化修饰的赖氨酸位点改造为精氨酸的方式,避免了酰化修饰的发生,一定程度上解除了赖氨酸丙二酰化的抑制作用,提高了赤松素的产量。该研究证明酰基-CoA前体量的增加能够提高产物产量的同时,也增加了赖氨酸酰基化修饰的水平,并对产物合成途径产生抑制作用。这是细胞针对内源性及外源性产物合成途径做出的反馈调控机制,涉及到不同类型产物的生物合成中。(4)基于代谢物变构调控的乙酰转移酶功能研究:在研究蛋白酰化修饰影响代谢途径的基础上,我们同时探究代谢物对酰化修饰系统的调控作用。我们发现桔橙小单孢菌(Micromonosporaaurantiaca)菌中包含一种同时含有ACT结构域和GNAT结构域的蛋白乙酰转移酶MaKat。通过FRET实验,我们证明Cys和Arg可能与ACT结构域相互作用并引起构象的变化。此后,我们进一步证明Cys和Arg可以提高MaKat的活性,并提升底物乙酰-CoA合成酶MaAcs的乙酰化水平,即证明MaKat是一种氨基酸调控型乙酰转移酶。这种新型乙酰转移酶的发现,表明放线菌中蛋白的乙酰化水平以及乙酰转移酶的活性可能与细胞内氨基酸的浓度密切相关。该研究不仅丰富了我们对原核生物蛋白乙酰转移酶家族的认知,同时也为代谢产物作用于酰化修饰系统的研究打下了基础。
【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q78
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本文编号：1293770