马铃薯油菜素内酯合成限速酶基因StCPD和StDWF4对干旱和盐胁迫的响应

发布时间：2017-12-17 12:18

  本文关键词：马铃薯油菜素内酯合成限速酶基因StCPD和StDWF4对干旱和盐胁迫的响应

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【摘要】：油菜素内酯(Brassinolide,BL)是第六大植物激素。目前,在各种作物中已共发现70多种油菜素内酯化合物,总称为油菜素内酯类化合物(Brassinosteroids,BRs)。CPD和DWF4基因分别编码C-3氧化酶和C-22羟化酶,均被认为是BRs合成的限速酶(Normura and Bishop,2006;Bancos et al.,2006)。近年来对BRs应用报道很多,但对植物抵抗环境胁迫的能力,特别是通过转基因手段提高植物抗逆性的研究报道较少。本文以马铃薯为材料,从中克隆到与拟南芥CPD和DWF4基因同源的全序列,分别构建由花椰菜花叶病毒启动子(CaMV 35S)驱动的植物过表达载体;采用MicroRNA(miRNA)技术构建了pRS-CPD-Ri干扰表达载体,通过农杆菌介导法将这些载体分别导入“紫花白”马铃薯中,获得转基因系,对这些转基因系的形态学、分子生物学和生理生化特征进行分析与比较。主要结果如下:1.从马铃薯中分别克隆出与NCBI中的电子克隆序列(GenBank accession XM_006338792.1和XM_006340546.1)同源的全序列,分别命名为StCPD和StDWF4,序列大小分别为1473bp和1476bp,分别编码490和491个氨基酸。St CPD与拟南芥CPD编码的CYP90A1有77%的同源性,StDWF4与拟南芥DWF4编码的CYP90B1有74%的同源性,分别命名为StCYP90A和StCYP90B。2.将StCPD和StDWF4分别插入植物表达载体pBI121,构建CaMV 35S启动子驱动的过表达载体pBCPD和pBDWF4。通过农杆菌介导法分别导入“紫花白”马铃薯,各得到11个和5个StDWF4基因转基因系。qRT-PCR法分析以上各转基因系的基因表达水平,所有转基因系的基因表达量均高于对照(NT),C10除外。在过表达StCPD基因株系中,StDWF4基因与StCPD基因的转录水平呈负相关。而在过表达StDWF4基因株系中,StCPD基因与StDWF4基因的转录水平呈正相关。基因表达组织器官特异性分析显示:StCPD在叶中表达量最高,茎次之,根中最低;StDWF4在根中表达量最高,茎次之,叶中最低。3.对转StCPD基因和NT马铃薯试管苗进行PEG模拟干旱胁迫处理,分析干旱处理与NT植株的生理生化指标、抗氧化酶活性及表型差异,结果表明,StCPD基因过表达的马铃薯植株基因相对表达量显著高于NT,随胁迫时间延长,基因相对表达量逐渐增加,直到处理48h时略有下降。与NT相比,转基因植株的丙二醛(MDA)含量降低;脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖含量均提高;超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、谷胱甘肽还原酶(GR)和抗坏血酸过氧化物酶(APX))酶活性均显著提高。随胁迫时间的延长,转StCPD基因和NT植株中,MDA含量逐渐增加,处理48h时略有下降;脯氨酸和可溶性糖含量持续增加;可溶性蛋白含量持续降低;SOD、POD、GR、CAT和APX酶活性均先增强,48h时略有下降。干旱处理下,转StCPD基因植株长势明显优于NT植株,株高、茎粗、根长、鲜重等指标都明显高于NT植株。4.对转StDWF4基因和NT马铃薯试管苗进行NaCl模拟盐胁迫处理,分析其生理生化指标、抗氧化酶活性及表型差异,结果表明,转St DWF4基因马铃薯植株较NT基因相对表达量显著增高,随胁迫时间延长(0-24h),基因表达量逐渐增加。无论盐胁迫还是对照处理,转基因植株较NT的MDA含量显著降低;对照和盐胁迫条件下,转StDWF4基因马铃薯脯氨酸含量是NT的1.25-1.55倍,可溶性蛋白含量为1.12-1.45倍,可溶性糖含量为1.41-2.89倍,SOD、POD、GR、CAT和APX酶活性分别为1.19-1.70倍,1.19-2.02倍,1.41-2.89倍,1.16-2.15倍,1.17-1.62倍。随盐胁迫时间延长,StDWF4基因过表达和NT植株中,MDA、脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量及SOD、POD、GR、CAT和APX酶活性均增强。盐胁迫下,转StDWF4基因植株长势明显优于NT植株,株高、茎粗、根长、鲜重等指标都明显高于NT植株。5.利用人工microRNA技术,以pRS300载体为基础,设计用于沉默马铃薯油菜素内酯合成限速酶基因StCPD的amiRNA,并构建表达载体p RS-CPD-Ri,将其导入“紫花白”马铃薯中进行遗传转化,获得5个转基因株系。CPD基因表达水平分析显示,Ci1-Ci5转基因系StCPD基因相对表达量分别为0.22,0.52,0.10,0.32和0.43,均较NT显著降低。组织表达特异性分析表明,St CPD的表达量依次为叶茎根。转基因植株的株高、茎粗、根长和植株鲜重等指标均较NT显著下降。6.对基因表达量最低的p RS-CPD-Ri转基因系Ci1,Ci3和Ci4试管苗,进行PEG模拟干旱胁迫处理0 d,2 d,4 d和6 d,分析CPD基因表达情况、MDA和脯氨酸含量及表型变化。结果表明:转p RS-CPD-Ri基因株系CPD基因相对表达量明显低于NT,尤其是干旱处理6d时,前者是后者的1.47倍;随胁迫时间延长,基因表达量持续增强。干旱胁迫下,转p RS-CPD-Ri基因马铃薯植株为NT MDA含量的1.07-1.17倍;而对照处理前者是后者的1.02-1.29倍;在对照和干旱条件下,StCPD基因干扰表达的马铃薯脯氨酸含量分别是NT的0.55-0.90倍,0.57-0.84倍。干旱处理15d后,转基因植株株高、茎粗,根长,鲜重及薯的大小和鲜重等都明显低于NT。以上结果表明:StCPD和StDWF4基因在马铃薯干旱和盐胁迫的响应过程中具有重要调控作用。
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2;S532

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本文编号：1300086