雨生红球藻异养细胞光诱导积累虾青素工艺的优化与放大

发布时间：2017-12-18 08:17

  本文关键词：雨生红球藻异养细胞光诱导积累虾青素工艺的优化与放大

  更多相关文章： 雨生红球藻 天然虾青素 异养 光诱导 机理

【摘要】：天然虾青素是一种超强的抗氧化剂,具有巨大的经济价值和广阔的市场前景,而雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)细胞被称为天然虾青素的“浓缩品”,因此培养雨生红球藻积累天然虾青素是当今微藻生物技术领域的研究热点。传统培养工艺通常分为两阶段：(1)绿色细胞的光自养培养；(2)绿色细胞在高光照、缺氮等胁迫条件下积累虾青素的光诱导。绿色细胞的光自养通常在逐级(一般为3级)放大的光生物反应器中进行,培养过程易污染且营养与光强协同控制难度大；第二阶段胁迫条件下虾青素合成的机理尚未明晰,虾青素积累效率较低,光诱导条件优化与反应器放大等研究也亟待进一步开展。为解决上述问题并对相关机理进行深入探讨,本文首先用异养代替传统的第一阶段光自养从而获得大量细胞,并观测异养过程中藻细胞状态的显著变化。然后摸索不同状态的异养细胞进行光诱导产虾青素的可行性,同时开展异养转光诱导的机理研究,提出光适应的策略；最后,对雨生红球藻异养细胞光诱导产虾青素的工艺进行放大研究,以期充分发挥异养效率高的技术优势并突破雨生红球藻传统的光自养产虾青素的技术瓶颈。主要内容和结论如下：(1)雨生红球藻异养过程及放大研究：本文首先在摇瓶上比较了雨生红球藻异养、自养及混养在细胞生长方面之差异,混养细胞增长速率最快,最后所达到的细胞数目也较高,达到55.5±2.97×104 mL-1,而异养及自养所能达到的细胞数目则分别为36.4±1.9×104 mL-1和9±0.55×104mL-1。随后的补料分批培养过程表明,利用碳源抑制效应可以获得不同状态的细胞,主要表现为单细胞重量差别较大(介于0.2～3.5 ng cell-1)；异养过程中,胞内的生化组成发生显著变化,主要为蛋白含量持续下降,从初始的约45.67±2.65%降为异养结束时的14.16±0.51%,而碳水化合物及油脂的含量则从初始的12.45±0.72%及17.35±1.00%分别提高到45.444±1.64%和30.50±±1.10%；细胞形态也发生着显著变化,由绿色游动细胞逐步转变为不动胶壳细胞及厚壁孢子态细胞。(2)光诱导条件的研究：异养结束时胞内虾青素含量很低,仅为0.1-0.5%,因此需要进行光诱导以促使虾青素的累积。摇瓶诱导的结果表明,初始的最佳碳、氮源为醋酸钠及硝酸盐,含量分别为20 mM及2 mM；诱导的pH控制在7-8,适合的pH缓冲体系为40 mM HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)；适合的诱导光强为400 μmol photons m-2s-1；红光促进细胞的生长,而蓝光则有利于胞内虾青素的积累,白光是最简单和有效的光源；同等强度的人工光与自然光的诱导结果接近；连续光照条件下的细胞干重及胞内虾青素含量分别为1.9±0.05 g L-1和3.81±0.05%,12 h：12 h光暗循环条件下相应的值为1.54±0.03 g L-1和2.48±0.08%,分别比前者低了18.9%及34.9%；初始细胞密度与光照强度协同影响光诱导的结果,单细胞受光强度决定了最终的虾青素产量；在0.1～0.6 vvm的通气量范围内,诱导过程pH及诱导结果均接近,为使得藻液充分混合,0.2 vvm的通气量较为合适。(3)转光诱导前对异养细胞进行光适应可以实现稳定高效的诱导：不同状态异养细胞光诱导后的结果相差较大,越接近厚壁孢子态的细胞的诱导效果越差。针对这种差异性和不稳定性,开展了对异养细胞光适应的研究,结果表明：不经过适应直接转入强光400 μmol photons m-2 s-1诱导,则光漂白的细胞数目约占25%；适应阶段适宜的中低光强为100μmol photons m-2 s-1,通过光适应能够显著减小由异养转入光诱导时细胞的死亡率,表征光合性能的Fv/Fm值则由异养结束时的0.6升高到0.8,表明通过1天的光适应,胞内的光合系统得到恢复。异养藻细胞转入光诱导时其光合系统进行了自我修复,光合作用相关的D1蛋白等得以再生,其含量先逐步升高再降低；光合作用相关蛋白PsbO、PetC等的活性则逐步下降,表明在逆境的条件下,雨生红球藻细胞具有自我防御能力,其通过促进胞内虾青素的合成以抵御外界的胁迫条件；光适应很好地解决了不同状态异养细胞诱导结果不稳定的问题。采用光适应策略对异养得到的三种状态细胞即绿色游动细胞、不动胶壳细胞及厚壁孢子细胞进行了诱导结果的对比研究。(4)不同类型的反应器中光诱导工艺的放大和优化：2,000 L跑道池的诱导效果较好,其细胞干重产率比200 L跑道池和10,000 L跑道池分别高近32.6%与41%；细胞在300 L平板式反应器中诱导约11天后的细胞干重与虾青素含量比15 L平板式反应器低了24.5%及16.82%,显示出平板反应器存在放大效应,但可以通过加内部光源和全天候人工光照来解决,使得诱导效果与对照相当；柱式反应器放大后仍然较适合用于光诱导,70L柱式的诱导效果仅比1L柱式低了3.9%。(5)诱导工艺在多地户外条件下的验证及虾青素产量与诱导光照总量、诱导平均温度等理化因素之间模型的建立：对雨生红球藻异养细胞光诱导高产虾青素这一新模式的可行性,在不同气候的多地户外条件下进行了验证；同时光照总量、平均温度与虾青素产量之间的关系研究表明：在整个诱导阶段,虾青素的体积产量与日光照总量之间符合Logistics关系；同时诱导的理论产量与诱导过程的平均温度之间符合Gauss关系,其在平均温度为22.7℃时候达到最大值,为准确预测诱导诱导结果提供参考。综上所述,对异养的条件优化实现了雨生红球藻的高效培养,比较分析了异养细胞生化组成及光合系统差异后,优化了异养转光诱导的培养条件并针对性地提出了光适应的策略,实现了异养的高效率与异养细胞光诱导产虾青素的高效率两者的统一；异养细胞经过光诱导产虾青素的可行性在多地不同气候条件下得到了验证,光诱导过程虾青素积累与光照、温度之间的模型随之建立；最后对光诱导过程中的光生物反应器进行了初步研究,成功优化并放大了光诱导工艺。本文的研究为雨生红球藻异养细胞光诱导高产虾青素这一新模式的产业化提供了重要的理论基础和实验依据。
【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q949.2;TQ28

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 庄惠如,陈必链,卢海声,施巧琴,陈荣;不同激光对雨生红球藻的刺激效应[J];激光生物学报;2000年04期

2 叶勇,应巧兰;雨生红球藻3个株系的生长及对光盐反应初探[J];应用与环境生物学报;2001年01期

3 胡章立,吴玉荷,罗杏桃;雨生红球藻细胞类型转化影响因子的协同作用[J];深圳大学学报;2002年03期

4 曹平华,李晓霞,禹学礼,陶林;雨生红球藻在不同培养基中的生长效果比较[J];河南农业科学;2004年04期

5 李晓霞,曹平华,禹学礼,陶林;雨生红球藻在不同培养基中生长效果的研究[J];黑龙江畜牧兽医;2004年08期

6 张英,蔡明刚,齐安翔,金贵娥,王鑫煌;维生素B_1、B_(12)在雨生红球藻不同培养阶段的作用研究[J];厦门大学学报(自然科学版);2004年S1期

7 滕长英,梁成伟,秦松,曾呈奎;雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)基因工程选择试剂的筛选[J];海洋与湖沼;2005年04期

8 陈兴才,黄伟光,欧阳琴;雨生红球藻的培养及虾青素累积条件的探讨[J];福州大学学报(自然科学版);2005年02期

9 陈兴才;黄伟光;欧阳琴;;雨生红球藻培养及虾青素累积条件探讨[J];中国食品学报;2006年04期

10 吴霞;康瑞娟;丛威;谭天伟;;转光膜在雨生红球藻养殖上的应用[J];过程工程学报;2006年06期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 孙燕妮;刘建国;殷明炎;;无机碳与雨生红球藻细胞调节物质[A];中国藻类学会第十一次学术讨论会论文摘要集[C];2001年

2 魏东;王亚丁;;不同诱导条件下雨生红球藻积累类胡萝卜素的规律研究[A];中国藻类学会第十一次学术讨论会论文摘要集[C];2001年

3 陈兴才;黄伟光;欧阳琴;;雨生红球藻培养及虾青素累积条件探讨[A];中国食品科学技术学会第五届年会暨第四届东西方食品业高层论坛论文摘要集[C];2007年

4 陈兴才;黄伟光;欧阳琴;;雨生红球藻培养及虾青素累积条件探讨[A];中国食品科学技术学会第五届年会暨第四届东西方食品业高层论坛论文摘要集[C];2007年

5 王铭;李爱芬;张成武;;雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)碳酸酐酶活性在不同理化因子条件下的响应[A];庆祝中国藻类学会成立30周年暨第十五次学术讨论会摘要集[C];2009年

6 李哲;蔡明刚;李晓梦;齐安翔;王蕴;黄水英;;不同波段可见光对雨生红球藻生长与虾青素积累的影响[A];中国海洋湖沼学会第九次全国会员代表大会暨学术研讨会论文摘要汇编[C];2007年

7 刘京华;黄青;;应用红外光谱显微成像技术观测单细胞雨生红球藻虾青素代谢过程[A];第十七届全国光散射学术会议摘要文集[C];2013年

8 庞严军;陈秋宜;刘志礼;;雨生红球藻生产虾青素研究进展[A];中国藻类学会第十一次学术讨论会论文摘要集[C];2001年

9 张雪芹;王潮岗;胡章立;;雨生红球藻外源基因表达系统的研究[A];中国海洋湖沼学会藻类学分会第七届会员大会暨第十四次学术讨论会论文摘要集[C];2007年

10 孙燕妮;殷明炎;刘建国;;雨生红球藻细胞生长抑制和转化诱导的信号物质[A];中国藻类学会第十一次学术讨论会论文摘要集[C];2001年

中国重要报纸全文数据库 前1条

1 杨琪;红球藻生物技术项目进入规模化生产阶段[N];中国食品安全报;2011年

中国博士学位论文全文数据库 前6条

1 章真;雨生红球藻异养细胞光诱导积累虾青素工艺的优化与放大[D];华东理工大学;2016年

2 张晓丽;雨生红球藻抗氧化作用及藻粉质量安全性研究[D];中国科学院研究生院（海洋研究所）;2006年

3 苗凤萍;雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）虾青素酯和脂肪酸的鉴定及差异表达基因的分析[D];中国科学院研究生院（武汉植物园）;2007年

4 滕长英;雨生红球藻控制虾青素合成的关键酶基因的转录调控元件[D];中国科学院研究生院（海洋研究所）;2003年

5 孟春晓;雨生红球藻中虾青素合成关键酶基因的顺式作用元件研究[D];中国科学院研究生院（海洋研究所）;2005年

6 闫晋飞;利用基因工程手段提高两种微藻的生物量与特定代谢产物产量[D];沈阳药科大学;2013年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 黄河儒;雨生红球藻提取物对糖尿病小鼠血糖及血脂水平的干预调节作用[D];浙江大学;2015年

2 陶云莹;四种环境因子对雨生红球藻（Haematococcus plivialis）生长、虾青素及内源激素积累的影响[D];中国海洋大学;2015年

3 刘峰;雨生红球藻优良藻株的诱变选育及其培养基的氮磷浓度的优化[D];中国海洋大学;2015年

4 陈俊琳;碳源对雨生红球藻生长和虾青素积累的影响及培养条件的优化[D];中国海洋大学;2015年

5 王铭;雨生红球藻绿色细胞的光合特性及其无机碳利用机制[D];暨南大学;2009年

6 李涛;营养对雨生红球藻Haematococcus pluvialis CG-11生长的影响及培养基优化研究[D];暨南大学;2009年

7 李福生;雨生红球藻培养周期中主要色素的动态变化[D];暨南大学;2009年

8 卢水秀;雨生红球藻表达载体的构建与电转化研究[D];华南理工大学;2010年

9 李莹;强光胁迫下雨生红球藻积累次生类胡萝卜素过程中的光合作用变化和光保护机制[D];华中师范大学;2005年

10 刘健晖;雨生红球藻Haematococcus pluvialis绿色营养细胞的培养条件研究[D];暨南大学;2006年

，

本文编号：1303459