基于代谢工程选育谷氨酸棒杆菌L-蛋氨酸高产菌

发布时间：2017-12-21 01:30

  本文关键词：基于代谢工程选育谷氨酸棒杆菌L-蛋氨酸高产菌　出处：《哈尔滨工业大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：L-蛋氨酸是唯一一种含硫必需氨基酸,在生命体各种重要的代谢活动中起着不可替代的作用,被广泛应用于多个领域。作为一种饲料添加剂,其需求量巨大且附加值高,工业上蛋氨酸的生产方法仍是化学合成法或水解蛋白法。鉴于L-蛋氨酸至今未实现微生物发酵法工业生产,且其代谢工程理论研究匮乏,本研究以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为出发菌株,基于代谢工程原理,构建了一株高产L-蛋氨酸的工程菌株,并分析不同遗传操作对L-蛋氨酸产量的影响,进而寻找出L-蛋氨酸生物合成途径中的关键靶点。其主要研究结果如下:为了获得一株过产L-蛋氨酸的平台菌株,本研究首先分析了不同L-蛋氨酸吸收系统缺失对L-蛋氨酸重吸收作用的影响。结果表明,Met D蛋白复合体是L-蛋氨酸的主要吸收系统,并且谷氨酸棒杆菌△met D的L-蛋氨酸产量最高。在谷氨酸棒杆菌△met D的基础上,通过诱变解除了来自末端代谢产物对L-蛋氨酸合成途径的反馈抑制作用。获得了一株具有L-蛋氨酸结构类似物抗性的突变株谷氨酸棒杆菌5-16,其L-蛋氨酸产量为2.54 g/L,提升了约9倍,对底物得率为0.028 mol/mol。该菌株中L-蛋氨酸分支合成途径的7个酶的转录水平均有显著提高,且遗传性能稳定,是一株优良的L-蛋氨酸生产平台菌株。为了强化L-蛋氨酸合成途径,本研究采用基因敲除和基因定点突变技术,阻断或弱化了L-蛋氨酸的竞争代谢径,并解除了来自中间代谢产物的反馈抑制作用。敲除thr B基因阻断了L-苏氨酸合成,替换dap A基因的强起始密码子为弱起始密码子削弱了L-赖氨酸分支途径,定点突变lys C基因和pyc基因解除天冬氨酸激酶和丙酮酸羧化酶的反馈抑制作用,最终获得谷氨酸棒杆菌LY-4。结果表明,天冬氨酸激酶节点对L-蛋氨酸的生物合成有极显著影响,L-蛋氨酸产量最终上升至5.89 g/L,对底物得率为0.072 mol/mol。在谷氨酸棒杆菌LY-4遗传背景下,敲除mcb R基因不利于L-蛋氨酸生产。构建了一个新型大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭组成型表达载体p LY-4。其具有一个含11个酶切位点的多克隆位点MCS;具有氯霉素抗性和基于alr基因的无选择标记两套筛选系统,氯霉素抗性标记适用于实验室规模操作,alr基因作为筛选标记可满足无抗生素条件下的发酵生产;携带tac M强启动子,并且去除了lac Iq基因对启动子的诱导表达,为组成型表达载体。通过对表达载体p LY-4性能的验证,证明p LY-4是一个适用于谷氨酸棒杆菌工业发酵生产的新型载体。在谷氨酸棒杆菌LY-4的基础上,比较不同遗传操作增加胞内NADPH供应对L-蛋氨酸产量的影响,结果表明异源表达gap C基因能够显著提高L-蛋氨酸产量。最终利用新型表达载体p LY-4在谷氨酸棒杆菌LY-4中过表达外源基因gapC,获得重组菌株命名为谷氨酸棒杆菌LY-6,发酵结果表明L-蛋氨酸产量上升至7.23 g/L,对底物得率为0.110 mol/mol。探索一些低价值原料作为碳源和氮源进行发酵生产L-蛋氨酸,降低生产成本。利用响应面法优化谷氨酸棒杆菌LY-6的发酵培养基成分和发酵工艺参数,用上述优化后培养基成分及工艺参数进行发酵,最终L-蛋氨酸产量达到9.88g/L,比优化前提高了26.82%,对底物得率也提高到0.133 mol/mol。
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q93

【参考文献】

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本文编号：1314189