L-periaxin蛋白结构与功能研究

发布时间：2017-12-21 18:19

  本文关键词：L-periaxin蛋白结构与功能研究　出处：《山西大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

  更多相关文章： Periaxin NLS结构域 DRP2 Zwint-1 CMT

【摘要】：轴周蛋白Periaxin是施旺氏细胞中特异表达的支架蛋白之一。在施旺氏细胞包裹轴突形成髓鞘过程中,Periaxin调节着髓鞘的延展与修复、影响轴突的直径大小及细胞内外信号传递。缺失或突变periaxin蛋白的编码基因PRX,将破坏外周周神经系统中神经纤维的聚集,从而引发脱髓鞘型腓骨肌萎缩症CMT 4F亚型的发生。Periaxin蛋白还可作为哺乳动物品状体纤维细胞膜的骨架蛋白,在跨膜信号传递、营养物质输送等过程中发挥作用。PRX基因编码两种长短不同的periaxin蛋白：L-periaxin和S-periaxin。 L-periaxin包含4个结构域：N端PDZ结构域、核定位信·NLS结构域、重复区域以及C端酸性区域；S-periaxin只包含PDZ结构域。木研究主要利用重组蛋白的表达、细胞脂质体转染、荧光光谱、细胞定位、免疫共沉淀、双分子荧光互补等多种蛋白相互作用研究手段,分析不同结构域在L-periaxin蛋白发挥功能中的作用。具体研究结果如下：1、以PRX基因为模板,将L-periaxin全长及各结构域,分别克隆到真核表达载体上,利用脂质体转染、细胞定位、Western blot等实验手段,明确了L-periaxin蛋白在RSC96细胞中存在多样性的细胞定位；其中L-periaxin的PDZ结构域调节L-periaxin核输出,NLS结构域影响核输入；结构域突变体EGFP-L-periaxindelPDZ定位细胞核；而EGFP-L-periaxindelNLS定位于胞质。细胞增殖实验表明,过表达PRX基因(L-periaxin+/+)及pEGFP-L-periaxindelPDZ转染细胞后,细胞增殖速率明显高于对照组；而NLS结构域缺失突变体pEGFP-L-periaxindelNLS转染细胞导致细胞生长速率明显低于对照组。进一步的研究发现,L-periaxin的酸性结构域同样影响L-periaxin的定位,其影响机制与Akt激酶诱导的L-periaxin磷酸化存在相关性。经Scansite预测,将L-periaxin的1439位Ser残基分别突变为Ala(S/A)或Glu(S/D),定位结果显示,L-periaxin-1439(S/A)显示在细胞核中定位高于WT-L-periaxin。而L-periaxin-1439(S/D)在细胞膜定位高于野生型WT-L-periaxin。L-periaxin不同的细胞学定位与其特殊的结构域分布相关。2、DRP2属于抗肌萎缩类蛋白家族,含有954个氨基酸残基,包括有N端2个类血影蛋白(spectrin like repeat)结构域和HWW结构域,以及C端ZZ-type锌指结构域和coiled-coil结构域。DRP2是第一个被报道与L-periaxin存在互作的糖蛋白,但参与两蛋白彼此互作的区域以及二者具体的互作机制并不清楚。本研究通过Co-IP实验方法,首先明确L-periaxin蛋白NLS结构域是与DRP2蛋白N端相互作用的关键区域。L-periaxin蛋白NLS结构域包括有：NLS1(118-139 aa),NLS2(162-175 aa)以及NLS3(183-194 aa)3个亚结构域。重组表达L-periaxin蛋白NLS, NLS1, NLS2以及NLS3结构域,以及DRP2蛋白N端不同结构域。GST pull down、双分子荧光互补、荧光光谱以及共定位结果表明：NLS2和NLS3为L-periaxin蛋白与DRP2蛋白互作的关键区域,而DRP2蛋白N端180-384 aa,即spectrin like 2+WW区域与L-periaxin蛋白NLS2和NLS3互作最为明显;进一步细胞定位结果表明,L-periaxin蛋白NLS1亚结构域只参与L-periaxin蛋白的核输入。L-periaxin与DRP2互作区域的精细定位,为进一在蛋白水平探讨L-periaxin与脱髓鞘型腓骨肌萎缩症4F亚型的发生机制提供参考。3、着丝粒相关蛋白Zwint-1是细胞有丝分裂过程中重要的检查蛋白,同时Zwint-1与DRP2蛋白N端1-384区域也存在特异性的结合。为进一步明确L-periaxin、DRP2与Zwint-1三者之间关系,分别构建了Zwint-1的真核及原核表达载体,Co-IP及pull down结果表明：DRP2血影蛋白结构域,即N端1-349区域,是其与Zwint-1结合的关键区域；进一步分子互补实验结果表明,L-periaxin-NLS蛋白的过表达,明显消弱DRP2与Zwint-1蛋白的结合。L-periaxin与Zwint-1竞争性结合DRP2蛋白的作用模式,为深入研究L-periaxin与DRP2蛋白的互作机制,以及施旺氏细胞的成熟与发育等提供参考。4、CMT是一种常见的常染色体显隐性遗传病,目前共发现有10多个亚型,克隆到至少30个疾病基因。通过借助孟德尔遗传疾病OMIN数据库及文献报道,共搜集到与CMT相关的71个候选基因,通过在线工具DAVID及GO富集,分析CMT相关突变基因中单核苷酸突变位点的分布与功能：进一步通路富集结果表明：氨酰t-RNA合成信号通路(hsa00970)与CMT类疾病的发生盟著相关。对于periaxin蛋白细胞定位、蛋白互作网络的构建、及CMT相关突变基因的代谢通路研究,将为施旺氏细胞的发育及再生、CMT 4F疾病的全面认识等提供重要的参考。
【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q51

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本文编号：1316708