纳米铜和硫酸铜暴露致斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）中毒机理的比较研究

发布时间：2017-12-23 07:20

本文关键词：纳米铜和硫酸铜暴露致斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）中毒机理的比较研究　出处：《南京农业大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：纳米铜(Cu-NPs)的诞生给畜牧兽医行业、饲料工业和养殖业的发展带来了技术上的革命。然而由于纳米材料独特的纳米效应,导致Cu-NPs可能对生态系统带来损害,其生物安全性资料极为匮乏。如今,Cu-NPs已在生产生活领域被广泛应用(如:抗菌消毒剂、纺织、鱼药等),但最终汇集到海洋环境中。斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)是我国沿海地区重要的养殖对象,其受到Cu-NPs的影响是不可避免的。目前,在养殖过程中常使用硫酸铜(CuS04)达到杀菌除藻的目的,但于此同时,离子Cu对鱼类产生较大的毒害,因此新型Cu药剂(Cu-NPs)的应用对水产养殖具有重大意义,然其应用基础理论较为缺乏。在本研究中,我们利用传统毒理学的研究方法结合现代组学技术系统比较研究Cu-NPs和离子Cu暴露对斜带石斑鱼及其致病弧菌的毒性作用,从而较为全面的获得Cu-NPs和离子Cu各自的毒性作用特点和毒性机制信息。本研究为探索海洋纳米毒理学的研究提供理论基础和实践经验,为Cu-NPs在海水养殖中的使用提供理论指导。试验分为七个部分,主要结果如下:1)纳米铜和硫酸铜暴露对斜带石斑鱼生长及积累效应的研究。结果如下:通过透射电镜分析表明Cu-NPs的初始粒径大小为85 ±29 runm (n=60),有积聚现象。通过纳米追踪分析表明Cu-NPs在海水中的平均粒径大小为210±130nm。整个试验过程无死亡。随着Cu-NPs和Cu~(2+)处理浓度的提高,增重率、特定增长率、蛋白质效率、饵料系数和脏体指数都呈现负面效应,其中Cu~(2+)诱导的负面效应比Cu-NPs明显。积累试验结果表明,在第0天(对照组),Cu在各组织中的分配比例顺序为剩余组织(含鱼头、鳍、骨头等)肌肉皮和鳞肝肠鳃胃。随着Cu-NPs和Cu~(2+)处理时间的延长,Cu在剩余组织中的分配比例降低(Cu~(2+)处理降低量高于Cu-NPs处理),但在其它组织中分配比例提高,尤其在肝组织中。Cu在各组织中的积累量随着暴露天数的增加而增加。吸收动力学表明,Cu~(2+)的吸收动力学曲线高于Cu-NPs。Cu~(2+)比Cu-NPs处理诱导更低的Km和Cmax/ Csat值,但诱导的BCF和In值在Cu~(2+)处理比Cu-NPs处理时高。当暴露到第10天时,Cu~(2+)与Cu-NPs具有同等的吸收量。2)纳米铜和硫酸铜暴露对斜带石斑鱼显微和亚显微结构的影响。显微结果显示:暴露25天后,各组织显示出不同程度的损伤,随着Cu-NPs和Cu~(2+)处理浓度的提高各组织的损伤程度也提高。对肝的损伤主要包括:血窦扩张和血细胞沉积在静脉中;对鳃显微结构的变化主要包括:二次片层基部增生,二次片层顶部棒状,鳃丝上动脉瘤。对肌肉的病变主要表现为:肌肉间隙扩大,部分肌束退变。在对照组中,斜带石斑鱼显示正常的肠道结构。低浓度的Cu-NPs和Cu~(2+)处理使肠道中杯状细胞数增多,随着处理浓度的升高,肠道中还出现绒毛糜烂现象。Cu-NPs对肠道的损害比Cu~(2+)严重。Cu-NPs和Cu~(2+)处理引起的肾组织病变有所差异,Cu-NPs主要引起肾脏中黑色素巨噬细胞增多,而Cu~(2+)处理诱导肾脏中红髓面积减少、白髓面积增加。Cu-NPs和Cu~(2+)暴露都诱导心脏中血细胞堆积和空泡变性。整个结果表明,Cu-NPs诱导肝、鳃、肌肉、肠和心脏中的损伤与Cu~(2+)类似,但在肾中结果不同。亚显微结果表明,正常斜带石斑鱼肝细胞核圆润,核仁在核中央,有一些脂滴。Cu-NPs和Cu~(2+)处理都使肝细胞核塌陷,脂滴消失,溶酶体消失,出现空泡化。正常斜带石斑鱼鳃中氯细胞较为圆润。Cu-NPs和Cu~(2+)处理都使鳃氯细胞塌陷,但氯细胞数增加。3)纳米铜和硫酸铜暴露对斜带石斑鱼氧化应激及凋亡的影响。结果表明:在肝、鳃和肠中,丙二醛(MDA)的含量随着Cu-NPs和Cu~(2+)处理浓度的升高而升高。在肝和鳃中,Cu~(2+)诱导MDA的升高量高于同等浓度的Cu-NPs,但在肠中结果相反。在肝和鳃中,总超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽(GSH)的含量随着Cu-NPs和Cu~(2+)处理浓度的升高而降低,Cu~(2+)诱导的降低趋势比Cu-NPs明显。在肠中,T-SOD活性随着Cu-NPs和Cu~(2+)处理浓度的升高而升高;而CAT活性和GSH含量随着处理浓度的升高而降低,Cu-NPs诱导的降低趋势比同等浓度的Cu~(2+)明显。细胞凋亡原位检测统计分析和Caspase-3, -9活性分析表明,凋亡指数和Caspase-3, -9活性都随着处理浓度的升高而升高。在肝和鳃中,Cu~(2+)诱导的凋亡指数和Caspase-3,-9活性要高于同等剂量的Cu-NPs;但在肠中此结果相反。在肝,鳃和肠中,琥珀酸脱氢酶(SDH)、Na+-K+-ATPase活性和线粒体细胞色素c含量都随着Cu-NPs和Cu~(2+)处理浓度的升高而降低,但胞浆细胞色素c含量随着处理浓度的升高而升高;这些变化在肝和鳃中在Cu~(2+)处理处有最大值,但在肠中在Cu-NPs处理处有最大值。4)纳米铜和硫酸铜暴露对斜带石斑鱼毒性作用的转录组学研究。结果表明:Cu-NPs在试验海水中暴露24-h后有约占初始总Cu量的0.83%的离子Cu释放出来。血液指标分析表明,Cu-NPs诱导血清中的皮质醇和血糖的升高量显著高于Cu~(2+)处理组,但胆固醇和甘油三酯的含量在Cu-NPs处理处有最低值。转录组分析表明,Cu~(2+)和Cu-NPs处理分别诱导了 1,428和2,239个基因显著表达;这些基因中有911个基因共表达。GO功能分析表明,共有28,788 GO条目被分配到11,417转录本。COG分析表明,有11,619个转录本被分为25类。其中,“信号传导机制”的数量最多,为1,745(15.0%)个。KEGG通路分析表明,基因数目最多的前3个Pathway依次为信号转导、免疫系统、运输和分解代谢。本试验利用RT-PCR的方法对转录组结果做了进一步验证,结果表明:基因在Illumina测序结果中的表达趋势与RT-PCR中的表达趋势一致,仅仅有表达量的不同,这可能是由试验计算方法不同造成的。5)纳米铜和硫酸铜暴露对斜带石斑鱼毒性作用的蛋白质组学研究。结果表明:Cu~(2+)和Cu-NPs处理分别诱导了 354和140个蛋白显著表达;这些蛋白中有75个蛋白共表达。GO功能分析表明,共有10,506 GO条目被分配到3,210个蛋白。COG分析表明,有3,294个蛋白被分为24类。其中,“只有一般功能预测”数量最多,为630( 19.1%)个。KEGG通路分析表明,蛋白数目最多的前3个Pathway依次为脂质代谢、免疫系统、糖代谢。本试验利用Western bolt的方法对蛋白质组结果做了进一步验证,结果表明:蛋白在iTRAQ测序结果中的表达趋势与Western bolt中的表达趋势一致。转录组与蛋白质组关联分析表明,共有21个蛋白在不同形式的Cu处理下在转录组和蛋白质组水平共表达:其中共同上调的有13个,共同下调的有8个。这些蛋白所涉及到的最主要的功能为脂质代谢。在本研究中,我们利用生理指标(脂质含量及脂肪酸组成)对脂质代谢做了进一步的研究。结果表明,Cu-NPs和Cu~(2+)暴露对脂代谢相关生理指标产生显著影响。6)纳米铜和硫酸铜暴露对斜带石斑鱼毒性作用的体外肝细胞验证。结果表明:Cu-NPs在细胞培养基中的粒径(100±35nm)大于Cu-NPs初始粒径(80±32nm),但比其在海水中的粒径小。Cu-NPs和Cu~(2+)暴露24-h后原代肝细胞活力显著降低;在Cu~(2+)处理降低的量显著高于Cu-NPs处理。本试验通过对氧化胁迫相关指标(ROS、MDA、T-SOD、CAT和GSH)、细胞凋亡、caspase-3,-8,-9活性以及线粒体和胞浆中的细胞色素c含量进行测定,发现其变化趋势与体内肝脏中一致,这对第四章结果做了进一步验证。在本试验中,Cu-NPs和Cu~(2+)暴露显著抑制抗氧化胁迫相关基因[SOD(Cu/Zn),SOD(Mn),CAT,GPx4]表达;而凋亡相关基因(p53,p38β,TNF-α)表达显著上升;这些在Cu~(2+)处理处有最大值。Western bolt分析表明,Cu-NPs和Cu~(2+)暴露24-h后,与空白比,SOD蛋白表达被抑制,而p53蛋白表达上升。Cu~(2+)诱导SOD和p53蛋白表达变化比Cu-NPs明显。7)体外致病菌毒性试验表明,哈氏弧菌、河流弧菌和副溶血弧菌的生长量被Cu-NPs和Cu~(2+)显著抑制。低浓度Cu(4.12mg/L)处理,Cu-NPs对这3株弧菌的生长抑制作用及氧化损伤比Cu~(2+)明显。高浓度Cu处理("g0.5g/L), Cu~(2+)对这3株弧菌所产生的抑菌圈直径大于Cu-NPs处理所产生。结合实际生产,Cu-NPs有望替代传统的CuSO_4在治疗石斑鱼弧菌病中的应用。
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：X171.5;S943

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