单细胞中生物小分子的快速分析研究

发布时间：2017-12-24 05:18

本文关键词：单细胞中生物小分子的快速分析研究　出处：《南京大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：细胞分析是分析化学、生物学和医学之间相互渗透而发展形成的跨学科前沿领域。随着现代生物学的发展,研究者发现培养基或者机体中的同种细胞存在多样性,或者说是异质性,因此传统在细胞群体上获得的“平均值”信息已经不能满足我们的需要。鉴于单细胞分析可以更加准确和全面地获得细胞生理状态和过程的重要信息,开展单细胞层面的高内涵研究势在必行。其中利用光学成像技术可以实现单细胞的高通量分析,并且还可以结合其他各种技术实现单细胞的全面、动态、可视的分析监测,已经成为当前单细胞分析领域的一个研究热点,越来越多的研究者致力于开发新的单细胞成像技术和新的用于成像的材料和探针。本论文就是围绕开发新型的、快速的单细胞光学分析技术和新型的光学探针及其细胞成像应用展开研究工作,实现了单细胞内生物小分子的快速分析检测。主要研究成果包括：1.基于电致化学发光成像对单细胞内葡萄糖的快速分析检测基于鲁米诺-H2O2体系的电致化学发光(Electrochemiluminescence,简称ECL)现象,结合我们课题组自己搭建的电致化学发光成像系统,首次实现了单细胞内生物小分子(葡萄糖)的成像分析检测。利用微加工技术制备细胞大小的ITO微孔阵列电极,在微孔电极上沉积金纳米颗粒(Au NPs)放大ECL信号,用以实现低浓度H2O2的可视化检测。经过条件优化后,ECL成像系统可以对浓度低至5μM的H2O2进行成像分析。在此基础上,利用Triton X-100破坏细胞膜,释放单个细胞内的葡萄糖到微孔中和微孔内的葡萄糖氧化酶反应生成H2O2。产生的H2O2与溶液中鲁米诺的衍生物(L012)反应,在施加的正电压下产生光信号。来自64个微孔/细胞的光信号在60s内由电感耦合装置(CCD)进行采集,从而通过成像实现了64个单细胞的平行快速分析。结果表明,在加入TritonX-100和葡萄糖氧化酶后,所有微孔中都能检测到更高强度的化学发光,这表明通过ECL成像可以成功检测单个细胞内葡萄糖。为了验证方法的可靠性,实验测试了含有更少胞内葡萄糖的“饥饿”细胞。较少的光强被检测到,证实了鲁米诺发光强度与细胞内葡萄糖的浓度有关。同时,来自同种细胞较大的光强差异,表明单个细胞中的葡萄糖浓度存在较大的偏差,从而首次揭示了细胞内葡萄糖的高度异质性。这种新发明的电化学发光测定方法将有可能被应用于对单细胞中更多的生物分子进行快速分析,以阐明细胞间的异质性。2.基于g-C3N4修饰微孔阵列电极增强电致化学发光对单细胞中胆固醇的全分析基于g-C3N4对鲁米诺-H202体系的电致化学发光(ECL)的增强作用,我们利用g-C3N4纳米片对微孔阵列电极进行修饰,得到对H202更高的检测灵敏度(500nM),实现了利用电致化学发光成像对单个细胞膜胆固醇和细胞内胆固醇的同时分析。为了实现单细胞中胆固醇的分析,首先在负载有单个细胞的微孔阵列引入能够产生H202的胆固醇氧化酶,用于膜胆固醇的发光分析;然后再用TritonX-100,胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶处理,使得细胞内的胆固醇产生的H202可以进行发光检测。在这两个步骤中均观察到微孔中产生的发光光斑,证实了单个细胞的膜和细胞内胆固醇的共同检测。对细胞内酰基辅酶A／胆固醇酰基转移酶(ACAT)的抑制导致细胞内胆固醇储存减少(较少发光)和膜胆固醇增加(更多的发光)。发光强度与胆固醇量的相关性证实了我们的方法可以同时检测不同的细胞状态下细胞膜和细胞内胆固醇,有可能为单细胞胆固醇相关通路的研究方面提供更多的信息。3.基于aza-bodipy的近红外荧光探针双波长检测细胞内过氧化氢实现细胞内的过氧化氢在近红外区域的荧光成像检测对于实现活体荧光分析具有重要的意义,但目前探针的激发／发射波长多集中于可见区。我们基于aza-bodipy系列荧光探针荧光强度高,光稳定性好,发射带宽窄,发射波长在近红外范围的优势,以aza-bodipy作为母核,设计合成了硼酸官能团修饰的氮杂-硼二吡咯亚甲基染料(azaBDPBA),吸电子基团硼酸与H202发生反应形成富电子的苯酚基团,其发射波长会发生红移。由于细胞在近红外区域自身发射的荧光背景干扰小,而且azaBDPBA对H202有很好的选择性,不受细胞内其它活性氧的干扰,将制备的azaBDPBA负载进入细胞,通过荧光谱图上呈现的双波长荧光的变化指示生物过程中细胞内H202的改变。利用该荧光探针与H202反应前后得到的比例光谱,首次实现了对细胞内H2O2具有高选择性的近红外区域双波长荧光成像检测。
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q2-33

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