氧化葡萄糖酸杆菌中NADH脱氢酶Ⅱ的酶学性质及其功能研究

发布时间：2017-12-24 06:15

本文关键词：氧化葡萄糖酸杆菌中NADH脱氢酶Ⅱ的酶学性质及其功能研究　出处：《华东理工大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：氧化葡萄糖酸杆菌(G. oxydans)因具有大量的膜结合脱氢酶、可以快速不完全氧化多种糖、醇化合物,成为一种重要的工业应用菌株。这些膜结合脱氢酶氧化产生的电子直接传递进入呼吸链,然而该菌呼吸链中一些组分的功能还有待研究,例如其中的NADH脱氢酶Ⅱ(NDH-2)。为了阐明NDH-2在G. oxydans DSM 2003中的生理功能,本论文通过基因的异源表达研究其酶学性质,通过基因的同源表达结合实时定量PCR、二维电泳、生物催化等实验研究该酶对菌体生长、能量代谢的影响。同时为了研究的需要以及基于G. oxydans分子操作工具的有限性,筛选适用于该微生物的新型强启动子。具体内容如下：第一部分,NDH-2的酶学性质及功能研究(1)NDH-2的酶学性质分析。G. oxydans DSM 2003中的NDH-2是一个编码409个氨基酸的脂溶性的膜结合蛋白,表观分子量约为45 kDa,为单亚基酶；拥有2个典型的GXGXXG保守区,属于A组NDH-2；最适反应温度为30℃,最适反应pH 7.5～8,非共价结合黄素辅因子FAD,无Fe-S簇,以NADH为唯一电子供体,不能还原NADPH,最适电子受体为辅酶Q2。(2)NDH-2过表达对碳源代谢的影响。使用其自身启动子实现NDH-2在G.oxydans中的同源过表达,这使得L-山梨糖还原酶(SR)、6-磷酸葡萄糖脱氢酶(6pgDH)和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6pgDH)酶活分别提高了47.4%、60%和36.4%,从而提高了胞内戊糖磷酸途径的活力,促进了L-山梨糖的代谢(较对照提高10倍),碳源利用率从28.7%提高至57.8%,最终OD600从11.54增加到17.91,提高42.8%。以上结果说明NDH-2可以通过影响胞内NADH/NAD+的平衡,引起一系列胞内代谢及代谢关键酶表达量的改变,从而影响碳源的吸收与利用,以适应菌体对迟效碳源(例如L-山梨糖)的利用以及因发酵液中次级产物增加而提升的生长压力。(3)NDH-2过表达对能量代谢的影响。NDH-2的过表达引起了呼吸链中各组分(bd、bo3、bc1、细胞色素c和转氢酶pntAB)转录水平不同程度的降低,但是却促进了一些电子传递相关蛋白(电子传递黄素蛋白、乙醇脱氢酶c亚基、ATP合成酶α1亚基、氧化还原酶铁硫结合亚基)表达量的提高,结合NDH-2过表达菌中增加的OUR以及H+/O(47.6%),说明NDH-2可以影响G. oxydans的呼吸强度、电子传递效率、氧化磷酸化效率及能量的产生,从而影响菌体的生长。此外,NDH-2的过表达没有影响膜上一些主要脱氢酶(葡萄糖脱氢酶、山梨醇脱氢酶、乙醇脱氢酶)的表达,说明NDH-2与膜结合脱氢酶介导的非氧化磷酸化和胞内代谢之间并不存在十分明显的电子竞争关系。第二部分,G. oxydans适用的新型强启动子的筛选及应用使用探针质粒筛选得到一启动子片段(104bp),命名为gHp0169。gHp0169可有效启动外源基因和内源基因在G.oxydans的高效表达,且启动活性略高于该菌中常用启动子G.oxydans_tufB。将gHp01矽用于构建高效表达2-葡萄糖酸脱氢酶(GA2DH)的G.oxydnns工程菌,产物2-KGA的时空产率达到29.86mM/h,较对照菌提高2倍,得率从84%提高至98.3%。
【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q936

【相似文献】