纤维素酶作为融合蛋白在大肠杆菌中的应用及其分泌机制的研究

发布时间：2017-12-24 07:06

本文关键词：纤维素酶作为融合蛋白在大肠杆菌中的应用及其分泌机制的研究　出处：《山东大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：大肠杆菌的遗传系统操作简便,遗传背景清晰,技术手段成熟,是目前较常用的蛋白表达菌株,多用于重组蛋白及药物蛋白的生产。但是在实际应用中,除了缺少翻译后的修饰系统外,大肠杆菌在表达异源蛋白时会由于积累大量错误折叠的目的蛋白,形成难以复性的包涵体结构。为了解决这个问题,研究人员提出了一系列的解决方法,如使用不同的启动子调控蛋白的表达水平、共表达分子伴侣、降低培养温度或者将目的蛋白以融合蛋白的形式分泌到菌体周质空间或胞外表达。其中,融合蛋白的分泌表达具有很多优势,例如简化了下游纯化程序,避免了蛋白酶的降解,周质空间的环境利于蛋白质的正确折叠,并且胞外积累目的蛋白可以减少对菌体代谢及生长的抑制作用等。在生物质能源转化方面,由于纤维素类的大分子底物无法直接被大肠杆菌菌体转运至胞内分解利用,重组酶的胞外分泌表达也是成功的关键因素。但是,在革兰氏阴性菌中蛋白质的分泌需要穿过两层膜结构。因此,大肠杆菌在实验室培养条件下并不具有很强的分泌能力。融合载体蛋白的选择不仅决定了目的蛋白的转运位置,也影响到了目的蛋白的最终分泌量。目前较常用的融合蛋白载体主要有两类：1)信号肽序列,可以将目的蛋白特异性的转运至周质空间,如Sec途径信号肽及TAT途径信号肽序列；2)大肠杆菌中过表达检测到的可分泌蛋白,一般可以通过某一未知的外膜途径将目的蛋白携带分泌至胞外,如内源性蛋白OsmY,YebF等。本文利用之前研究中所发现的一个于芽孢杆菌的纤维素酶催化结构域(Cel-CD),在大肠杆菌中过表达时可以被高效的分泌至胞外,具有作为融合载体蛋白的应用前景。所以选定Cel-CD作为本研究的目标蛋白验证其在融合蛋白分泌表达方面的应用,并通过进一步对Cel-CD在大肠杆菌中的分泌机制的检测确定了Cel-CD的N端氨基酸对于其可溶性表达及分泌的作用。随后,利用Cel-CD分泌表达融合蛋白的特性及其自身的纤维素内切酶活性构建了可将纤维素类物质转化为PHB的细胞工厂。一、Cel-CD高效分泌表达的机理研究由于在前期实验中已经验证Cel-CD的分泌是经过周质空间的两步法过程,并且是不依赖于自身原始信号肽序列的。Cel-CD自身序列的N端20个氨基酸同时起到了穿内膜及外膜分泌的信号肽作用。通过前期的氯霉素抑制SecA蛋白活性实验以及本章节利用N20融合GFP蛋白的荧光实验检测,我们确认Cel-CD在大肠杆菌中是通过SecB依赖的Sec途径穿内膜到达大肠杆菌的周质空间。而大肠杆菌外膜上存在的两步法分泌孔道主要有二型分泌系统(T2SS),五型分泌系统(T5SS)及外膜蛋白(OMPs)。通过敲除E. coli BL21(DE3)菌株相关蛋白的基因后检测Cel-CD的胞外积累,发现Cel-CD的分泌并没有受到抑制。因此,我们推断Cel-CD在大肠杆菌中通过某一未知的途径分泌到胞外。由于在对Cel-CD序列分析时,发现其不具有各型分泌系统的信号肽序列性质,也没有相关的信号肽酶酶切位点。我们将N20与其他常用的Sec途径信号肽进行序列比较,发现N20的n-region带有负电荷,整个N20的二级结构预测显示为无规则卷曲并且具有明显的亲水性及极性,并不具有传统信号肽的n-region、h-region及c-region的特征。为了检测N20序列上对Cel-CD分泌起关键作用的氨基酸位点,我们利用随机诱变试剂盒对N20序列进行随机诱变,检测突变株胞外分泌量的变化。由于大肠杆菌属于革兰氏阴性菌,具有双层膜结构,诱变株的分泌量变化既受穿内膜效率变化的影响也受穿外膜效率变化的影响。诱变结果显示,N20氨基酸序列疏水性提高及二级结构的改变(生成a-螺旋)都会引起穿内膜分泌量的提高,但外膜分泌受到一定程度的抑制。通过与其他可分泌蛋白的N端的替换实验我们也进一步验证了上述结论。以上结果说明,N20的分泌信号肽作用是折中了内膜及外膜分泌条件的结果。二、Cel-CD作为融合蛋白的应用在章节中,以Cel-CD为目标蛋白检测其在大肠杆菌中的应用。首先我们构建了Cel-CD的表达载体,发酵检测其在大肠杆菌中的分泌。通过DNS法检测胞外Cel-CD酶活,证明分泌到胞外的Cel-CD具有纤维素内切酶酶活。并通过电镜检测,证明表达菌体细胞膜完整,排除了菌体裂解对胞外Cel-CD积累的影响。也排除了Cel-CD的酶活对菌体细胞膜通透性造成的影响。前期通过N端的缺失实验,我们已经验证了Cel-CD的N端20个氨基酸对于其胞内可溶性表达及分泌起到了重要作用。在本章节中,我们进一步通过N端20个氨基酸残基与PelB的替代实验,证明了N端20个氨基酸同时起到了穿内膜及外膜分泌的信号肽作用。随后,我们选取了5组不同来源的蛋白质与Cel-CD及N20融合表达,以验证Cel-CD及N20是否具有携带底物蛋白可溶性表达及分泌的能力。通过对各发酵组上清的检测,我们发现Cel-CD与底物蛋白的融合可以有效的提高其在大肠杆菌中的可溶性表达,并可以将5组目的蛋白全部携带分泌至胞外,但是分泌效率受底物蛋白分子量的影响较大。而N20融合5组不同来源的底物蛋白后,对其可溶性的提高影响并不明显,但是在可溶性表达的基础上,均可以将底物蛋白融合携带至胞外。我们进一步检测了融合蛋白表达菌株的生长状态,与对照组相比,Cel-CD及N20融合蛋白对于菌体生长并没有明显的影响。结合以上实验结果,我们认为Cel-CD及N20均具有在大肠杆菌中作为载体蛋白分泌表达的能力,但适用范围不同。为了进一步增加融合蛋白的可溶性及分泌效率,我们尝试对培养基以及N端信号肽拷贝数做了优化。文献报道,TB培养基营养丰富并富含磷酸盐缓冲体系。我们使用TB培养基代替LB发酵检测N20融合蛋白的可溶性表达及分泌。结果显示,TB培养基针对原本就可溶的N20融合蛋白的可溶性表达具有促进作用,并可以进一步增加其分泌量。但对于不可溶的N20融合蛋白并没有显著作用。结果进一步说明了N20融合对于底物蛋白可溶性并没有显著的促进作用,但可以较高效的将目的蛋白携带分泌至胞外。由于N20具有穿内外膜信号台作用,为了提高信号强度,我们在N20序列的N端又增加了PelB信号肽序列以增加N端的信号肽序列数。选取了与N20后仅胞内可溶性表达的碱性磷酸酶作为底物蛋白进行发酵检测。实验结果显示,添加了pelB信号肽的实验组可以通过周质空间被进一步分泌至胞外。因此,我们认为增加N端信号肽数目对于N20融合蛋白的分泌能力具有较好的促进作用,但其适用范围还需要进一步的试验证明。三、Cel-CD作为双功能蛋白的应用在前期的实验中,已经验证分泌到胞外的Cel-CD具有较好的纤维素内切酶活性,并且具有携带其他目的蛋白分泌到胞外的能力。我们利用Cel-CD作为融合载体蛋白,选取了来源于嗜热裂胞菌的β-葡聚糖苷酶Tfu0937与其融合表达。在大肠杆菌中,融合蛋白Cel-Tfu0937可以被高效的分泌至胞外。通过酶活检测融合蛋白的胞外活性,发现既有纤维素内切酶活性也具有β-葡聚糖苷酶活性。因此具有构建大肠杆菌纤维素细胞工厂的潜力。PHB是一类可以被生物降解的聚酯,因此被广泛的应用于各个领域。在融合蛋白表达菌株中引入一条PHB合成途径——包含有乙酰乙酯辅酶A、β-酮硫酶以及PHB合酶的质粒,作为纤维素发酵利用的验证产物。选取了纤维素类物质CMC作为发酵底物,在不添加葡萄糖的培养基内发酵培养,收集菌体检测到了少量的PHB积累。结果证明,我们构建了一株可以利用纤维素类物质生产PHB的大肠杆菌,提供了一株有效利用纤维素为唯一碳源积累生物能源物质的基础菌株。我们进一步使用纤维素类物质的酶解产物——纤维二糖,作为唯一碳源做发酵检测。由于体系中不再需要纤维素内切酶的作用,我们构建了N20-Tfu0937融合蛋白,并检测到了胞外蛋白分泌及相应的β-葡聚糖苷酶酶活。不添加葡萄糖的培养基内发酵培养,收集菌体检测到PHB积累,并且相比于CMC为碳源时的产量明显提高。综合上述结果,我们构建了一个纤维素类物质的应用平台,可以被应用于多种纤维素类物质的水解转化,进行生物能源及生物材料的生产积累。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78;Q93

【相似文献】