SIRT6对人骨髓间充质干细胞功能影响的研究

发布时间：2017-12-25 21:11

本文关键词：SIRT6对人骨髓间充质干细胞功能影响的研究　出处：《山西医科大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的原始未分化细胞,其主要作用是维持组织内环境稳态和修复受损组织。干细胞大体可分为胚胎干细胞和成体干细胞:成体干细胞相对于胚胎干细胞由于其取材方便、来源丰富从而被广泛认可,尤其骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)是研究和应用最广的成体干细胞之一。干细胞移植特别是自体干细胞移植在许多疾病(例如糖尿病、周围血管疾病、心肌病,神经退行性疾病以及骨关节疾病等)的研究上取得了显著进展。随着研究的深入我们发现:在老年患者中的治疗效果不如年轻患者显著。有研究报道:衰老是影响干细胞治疗效果一个重要原因,随着年龄的增长,体内干细胞的数量,分化能力和增殖能力均下降。对于老年患者而言,使衰老的干细胞年轻化是改善治疗效果的一个重要途径。SIRT6是一个烟酰胺腺嘌呤而核苷酸(nicotinamideadenine dinucleotide,NAD+)依赖的组蛋白去乙酰化酶,通过调节染色体端粒结构改变,沉默相关的靶基因,是基因沉默调节蛋白。Mostoslavsky等发现在SIRT6基因敲除小鼠中,小鼠表现出早衰表型,且于四周左右死亡。Kanfi,Kawahara等人则证实SIRT6可以延长雄性小鼠的寿命延缓衰老。在细胞水平,SIRT6也被证实可以提高多种细胞的增殖能力,分化能力,使细胞衰老表型降低,相关的功能提高,使细胞年轻化。提示:SIRT6可能是一个抗衰老的因子。但是SIRT6对人的骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBM-MSCs)的作用还不清楚。本课题提出假设:SIRT6对于h BM-MSCs是一个抗衰老的因子,SIRT6基因敲除后,h BM-MSCs的相关功能均受损。基于以上假设本课题研究内容如下:1.不同年龄组hBM-MSCs的培养和鉴定2.检测SIRT6在不同年龄hBM-MSCs的表达3.检测不同年龄组hBM-MSCs的相关功能。4.检测sirt6-knockdown后hbm-mscs相关功能改变目的:1.证实sirt6在不同年龄hbm-mscs的表达有差异。2.证实不同年龄的hbm-mscs功能有差异。3.证实sirt6基因干扰后hbm-mscs的生物学功能表现为衰老。4.探索sirt6衰老之间的关系。方法:hbm-mscs的收集和培养:收集不同年龄人的骨髓,幼儿组(infant)27例,1-13岁,平均年龄=5.4±0.7岁,青年组(young)38例,16-35岁,平均年龄=25.9±0.8岁,老年组(old)53例,55-81岁,平均年龄=67.9±1.0岁。在人的髂后上棘收集骨髓后,以1ml骨髓与5ml10%fbsimdm培养基的比例将骨髓接种入t-25培养瓶中,待细胞达到80-90%融合时,将细胞以5000细胞/cm2的密度传代,实验中所用的细胞均为第四代细胞。hbm-mscs的鉴定:用干细胞表面标记染色和成脂、成骨分化两种方法来证明所培养的细胞为hbm-mscs。常规胰酶消化收集细胞后,制成浓度为106细胞/ml的单细胞悬液,取100μl悬液分别加入干细胞表变标记抗体cd105-fitc、cd34-pe、cd45-pc5和cd44-pe,室温避光孵育20min,用流式细胞仪检测培养细胞的cd105、cd34、cd45和cd44的细胞阳性率。按照说明书将培养的细胞分别用人的成骨、成脂诱导培养基诱导分化,诱导分化完成后分别用茜素红和油红“o”染色。sirt6和p16在hbm-mscs中mrna水平和蛋白水平的表达:分别用reversetranscription(rt)-pcr和real-timepcr检测sirt6和p16在hbm-mscs中mrna水平的表达,sirt6:前引物5’-gtcttccagtgtggtgttcca-3’,后引物5’-cccagtctaggatggtgtcc-3’;p16:前引物5’-ctcaccatggatgatgatatcgc-3’,后引物5’-aggaatccttctgacccatgc-3’;β-actin(actb):前引物5’-cctgaagtaccccatcgagc-3’,后引物reverse:5’-ctcttgctcgaagtccaggg-3’。rt-pcr产物条带用imagej软件计算,sirt6的相对mrna水平用sirt6/actb来表示(n=4/组)。sirt6的蛋白水平用westernblotting检测(sirt6抗体:1:250,abcam;actb抗体:1:2000,abcam),蛋白密度条带用imagej软件计算,sirt6相对蛋白水平用sirt6/actb来表示。p16的蛋白水平用细胞免疫荧光(immunocytoflurescence,icf)来检测。细胞用4%多聚甲醛固定后大鼠抗-p16抗体(1:100,santacruz)4℃湿盒孵育过夜,cy3-二抗(1:200)室温避光孵育1h,dapi染核37℃避光孵育10min。检测p16阳性细胞率=同一视野内红色阳性细胞数/同一视野内总细胞数(n=4/组)。sirt6在hbm-mscs中的定位:用icf来检测sirt6在hbm-mscs中的定位,细胞用4%的多聚甲醛固定后兔抗-sirt6抗体(1:200,abcam)4℃湿盒孵育过夜,fitc-二抗(1:200,北京博奥森公司)37℃避光孵育1h,dapi染核37℃避光孵育10min,用倒置荧光显微镜拍照并观察sirt6阳性细胞。细胞增殖能力检测:分别用brdu掺入法和细胞生长曲线计数法检测hbm-mscs的增殖能力。brdu掺入法:将细胞接种到24孔板中,待细胞融合达到40-50%时培养基更换为brdu培养基(10%fbsimdm包含3μg/mlbrdu),培养3天后brdu染色。用imagej软件计数brdu阳性细胞,计算brdu阳性细胞率。细胞生长曲线计数法:将细胞以7000细胞/孔的密度接种到12孔板中(每例细胞3个复孔),从第0天到第6天每隔1天计数一次细胞绘制生长曲线。细胞迁移能力检测:用划痕试验检测hbm-mscs的迁移能力,将细胞接种到6孔板中,待细胞达到100%融合时,用20μl的移液枪尖在孔的中央垂直划痕。用倒置显微镜分别在划痕后0h和24h拍照(日本olympus),用imagej软件计算细胞迁移率(n=4/组)。细胞死亡和凋亡检测:将hbm-mscs用h2o2(1000μm)处理6h后收集细胞,用annexin-v和pi染色(lifetechnologies)后,用流式细胞仪检测细胞凋亡。死亡细胞为pi阳性annexin-v阴性细胞,凋亡细胞为annexin-v阳性细胞(n=4/组)。sa-β-gal活性的检测:按照产品说明书用衰老检测试剂盒(中国,solaribio)检测sa-β-gal的活性。阳性细胞率=同一视野中蓝色细胞/总细胞数(n=4/组)。hbm-mscs中sirt6的基因干扰:按照产品说明书用一种sirna对hbm-mscs进行sirt6的基因干扰。将细胞以7000细胞/孔的密度用无血清无抗生素的imdm培养基接种到24孔板中,24h后加入3μlsirna-fam和2μllipofectamin2000(美国,invitrogen),转染6h后更换培养基,在荧光显微镜下观察转染是否成功,转染效率用流式细胞术检测fcm。sirt6的沉默效率用rt-pcr(转染后24h)和westernblotting(转染后72h)(n=4/组)。统计学分析:数据用mean±sd表示,数据分析用graphpadprism5,两组之间差异用t-test检验,3组使用one-或者anova检验,p0.05具有统计学意义。结果:hbm-mscs的鉴定:用流式细胞术检测hbm-mscs的细胞表面标记,我们发现培养的细胞cd105和cd44阳性细胞率均超过99%,并且三个年龄组之间没有显著差异。而cd34和cd45的阳性细胞率均低于1%,三个年龄组之间没有显著差异。培养的细胞成骨、成脂分化后分别有大量的茜素红阳性细胞和油红“o”阳性细胞。这些结果证明本实验所培养的细胞以及后续实验所用的细胞具有间充质干细胞表面标记且有成骨、成脂分化能力,具备hbm-mscs的特点。sirt6随着年龄的增加表达增加:sirt6是一个主要在细胞核中表达的蛋白,老年组(old)的sirt6无论在mrna水平还是蛋白水平均高于幼儿组(infant)和青年组(young)(p0.01)。sirna转染使sirt6表达下降:转染后6h用荧光显微镜观察fam检测hbm-mscs中sirna转染阳性率。未转染(空白对照组,control)的细胞呈fam阴性,但是阴性对照组(nc)和干扰组(sirna)呈fam阳性,但是老年组(old)的fam阳性细胞率低于青年组(young)(p0.01)。sirna有效降低了sirt6的表达:无论在mrna水平还是蛋白水平,老年细胞和青年细胞的干扰组(sirna)sirt6的表达均低于各自的阴性对照组(nc)(p0.01)。sirt6沉默后hbm-mscs增殖能力降低:三个年龄组的hbm-mscs均有brdu阳性细胞,其中幼儿组(infant)和青年组(young)的阳性细胞率高于老年组(old)的2倍(p0.01)。生长曲线也发现幼儿组(infant)和青年组(young)细胞的生长速度高于老年组(old)(p0.01)。这些提示:hbm-mscs的增殖能力随着年龄的增长呈下降趋势。sirt6sirna转染后,青年组和老年组的sirt6表达水平均降低。青年细胞和老年细胞sirna组的生长速度均低于各自的nc组(p0.01)。我们还发现老年sirna组的细胞几乎没有增殖能力。这些提示:sirt6可能在细胞生长和增殖能力发挥重要的作用。sirt6沉默后hbm-mscs迁移功能受损:划痕实验发现老年组细胞迁移率明显低于幼儿组和青年组。幼儿组和青年组的迁移率高于老年组的3倍(p0.01)。sirt6沉默后青年组和老年组hbm-mscs迁移能力均下降(p0.05)。这些提示:随着年龄的增长hbm-mscs的迁移能力下降,sirt6参与调节细胞的迁移能力。sirt6对hbm-mscs抗凋亡能力和氧化应激耐受能力的影响:hbm-mscsannexin-v和pi染色后用流式细胞术检测凋亡水平。我们发现老年组细胞的凋亡细胞率高于幼儿组和青年组的8倍(p0.05)。老年组的死亡细胞率也高于幼儿组和青年组,但是没有统计学意义。为了证明sirt6的抗凋亡能力,用sirna转染将sirt6沉默,我们发现细胞的凋亡细胞率和死亡细胞率均为发生显著改变。这些提示:随着年龄的增长hbm-mscs的抗凋亡能力降低,但是sirt6沉默后并未影响细胞的抗凋亡能力。为了证明年龄对细胞氧化应激耐受能力的影响,先将不同年龄组的hbm-mscsh2o2处理6h,再用annexin-v和pi染色细胞后流式细胞术检测细胞的存活率。我们发现老年组死亡细胞率明显高于幼儿组和青年组(p0.05),凋亡细胞率高于幼儿组和青年组的8倍(p0.01)。为了证明sirt6对细胞氧化应激耐受能力的影响,青年组的细胞用sirt6-sirna或者nc-sirna转染后h2o2处理6h,sirna组的死亡细胞率高于nc组的2倍。(p0.05),但是两组细胞的凋亡细胞率没有显著差异。这些提示:年龄增加了细胞对氧化应激的敏感性,但是sirt6的水平没有改变细胞的敏感性。SIRT6沉默后h BM-MSCs SA-β-Gal活性增加:SA-β-Gal活性是细胞衰老的一个特性,老年组的SA-β-Gal阳性细胞高于幼儿组和青年组的16倍(P0.01),青年组的细胞SIRT6沉默后,siRNA组的SA-β-Gal阳性细胞率高于NC组的2倍(P0.05)。这些提示:年龄促进细胞的衰老而SIRT6延缓细胞的衰老。SIRT6沉默后p16表达增加:p16的表达是细胞衰老的一个重要参数,在mRNA水平,老年组hBM-MSCs的水平高于幼儿组和青年组的2倍(P0.01),SIRT6沉默后,青年hBM-MSCs siRNA组的水平高于NC组的2倍(P0.05)。同样,老年hBM-MSCs p16阳性细胞率高于幼儿组和青年组(P0.01),SIRT6沉默后青年hBM-MSCs si RNA组的p16阳性细胞率明显高于NC组。再次证明:年龄促进细胞的衰老而SIRT6延缓细胞的衰老。结论:1.SIRT6是一个主要在细胞核中表达的蛋白,随着年龄的增长其在hBM-MSCs的表达增加。2.随着年龄的增长,hBM-MSCs的增殖能力、迁移能力、抗凋亡能力以及氧化应激耐受能力均下降,SA-β-Gal活性提高,p16的表达增加。3.SIRT6沉默后,hBM-MSCs的增殖能力、迁移能力和氧化应激耐受能力均下降,SA-β-Gal活性提高,p16的表达增加。4.年龄促进hBM-MSCs的衰老而SIRT6延缓细胞的衰老。
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R329.2

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