枯草芽孢杆菌及链霉菌表达系统的构建及应用研究

发布时间：2017-12-26 08:29

  本文关键词：枯草芽孢杆菌及链霉菌表达系统的构建及应用研究　出处：《江南大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和链霉菌(Streptomyces)表达系统最突出的特点是宿主菌具有GRAS(generally recognized as safe)地位,而且遗传背景清楚,遗传操作系统完善,具有开发成为继乳酸菌之后的食品级表达系统的潜能。虽然关于B.subtilis和Streptomyces表达系统的研究已经取得了一定的进展,但在表达调控元件开发及表达系统多样性方面,还远落后于Escherichia coli表达系统。本论文对B.subtilis内的启动子进行了比较并改造,构建B.subtilis高效分泌表达系统;利用B.subtilis群体感应现象-感受态形成的信号传导系统,构建新型细胞密度依赖型自诱导表达系统。另外,利用Streptomyces hygroscopicus WSH03-13来源的谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase,TGase)的启动子(P_(tg))及信号肽(SP_(tg))的预测序列构建Streptomyces分泌表达系统。具体研究内容如下:(1)B.subtilis高效分泌表达系统的构建。以AP为报告蛋白,构建表达载体,对比分析了启动子PHpa II、PyxiE、P43、PgsiB、Pluxs、Papr E和Pgrac的表达量及表达曲线。结果显示,启动子的活性及表达时间之间存在差异,其中,启动子PHpa II和PgsiB的活性最高。将6种启动子PHpa II、PyxiE、P43、PgsiB、Pluxs和Papr E分别与PHpa II串联后表达AP,结果显示PHpaII和Pgsi B串联后表达量提高最多。在此基础上筛选20种信号肽,构建高效分泌表达载体pBSG24-SPYncM。以B.subtilis WB600为宿主进行5 L发酵罐放大实验,AP的分泌表达产量达到1.7g/L。(2)B.subtilis细胞密度依赖型自诱导表达系统的构建。构建E.coli-B.subtilis穿梭载体pBSG01,以绿色荧光蛋白(GFP)为报告蛋白,研究srf操纵子的启动子PsrfA的表达特性。通过测定荧光强度和菌体生长曲线发现,PsrfA的表达呈现细胞密度依赖性。在四种营养梯度培养基中,LB培养基更适于PsrfA的表达。与PHpaII相比,PsrfA的表达量高于PHpaII。PsrfA可在四种宿主B.subtilis 168、B.subtilis WB600和B.subtilis WB800和BSG1681(ΔPsrfA)中高表达GFP,其中,宿主B.subtilis 168中的表达量最高,缺失基因组中的PsrfA并没有增加系统表达量。在培养基中添加1.5%的葡萄糖,启动子活性提高了1.2倍,系统表达量提高了4.6倍。将PsrfA的-10区和-35区突变为σA依赖的保守的-10区和-35区,启动子活性提高了2倍;添加1.5%的葡萄糖后,系统表达量进一步提高了8倍。利用该表达系统实现了异源蛋白AP分泌表达。(3)B.subtilis细胞密度依赖型自诱导表达系统的优化及高细胞密度发酵实验。构建产孢缺陷宿主菌BSG1682(ΔσF),与B.subtilis 168做宿主进行了比较。结果显示,表达GFP时,BSG1682(ΔσF)表达量比B.subtilis 168提高60%。将PsrfA-gfp整合到染色体表达时,整合PsrfA-gfp未影响菌体生长,表达量低于载体表达。将PsrfA的-10区、-35区及-16区分别或组合突变为相应的保守序列,发现突变-35区后表达量是对照PsrfA的2.5倍。将PsrfA分别与PHpa II和PgsiB串联,PsrfA-PHpa II(P17)的表达区间不变但表达量增加,PsrfA-Pgsi B(P16)表达区间没有明显延长且表达量降低。对P17的核心区进行组合突变,获得10个突变体,其中P23的表达量最高。含P23的表达系统可以实现异源蛋白纳豆激酶(NK)和AP时的高效表达。对含P23的表达系统进行发酵放大实验,生物量(OD600)可达30,是摇瓶实验的3.2倍;GFP的荧光强度是摇瓶的85%,但GFP的荧光量却是摇瓶的2.7倍。通过条件优化,进行高细胞密度发酵时的菌体浓度OD600达到122。(4)Streptomyces分泌表达系统的构建。利用P_(tg)-SP_(tg)为表达元件并在SP_(tg)的下游添加便于外源基因插入的多克隆位点(MCS)及提高转录效率的终止子(fd-ter),构建载体pSG01。利用该载体可在S.lividans1326中分泌表达TGase。对SP_(tg)序列中的链霉菌亮氨酸稀有密码子和信号肽酶识别位点优化后得到载体pSG02,利用该载体表达TGase时分泌表达量提高一倍。通过对TGase进行N-端测序,得到的N-端氨基酸序列与野生型一致,说明该表达系统能够成功分泌表达TGase。与链霉菌常用启动子PermE*表达TGase比较发发现,P_(tg)的表达量是PermE*的2.1倍,说明P_(tg)可作为一种强启动子用于链霉菌表达系统的构建。该表达载体可在其他链霉菌宿主中内分泌表达TGase以及异源蛋白苯丙氨酸脱氨酶(PAL)和氨肽酶(AP)。另外,对P_(tg)及SP_(tg)在E.coli中的功能进行了研究,结果显示,SP_(tg)在E.coli系统中能分泌TGase,而P_(tg)在E.coli系统中不能表达TGase。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78

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本文编号：1336552