水貂肠炎病毒VP2蛋白部分氨基酸位点磷酸化修饰对病毒增殖的影响

发布时间：2017-12-29 19:37

本文关键词：水貂肠炎病毒VP2蛋白部分氨基酸位点磷酸化修饰对病毒增殖的影响　出处：《中国农业大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：隐蔽期内病毒增殖的分子生物学过程,一直是病毒学研究人员关注的热点问题,病毒感染宿主细胞的过程,实质上是病毒蛋白质与宿主细胞内大分子物质相互作用的过程。因此,研究隐蔽期内病毒蛋白质结构及功能的变化,对阐明病毒增殖过程特别是衣壳蛋白装配等过程至关重要。蛋白质磷酸化修饰是研究蛋白质间相互作用的焦点,病毒蛋白质的磷酸化修饰,对其与宿主细胞蛋白质或病毒自身编码蛋白质间相互作用具有重要的意义。水貂肠炎病毒(mink enteritis virus, MEV)是细小病毒科细小病毒属成员,能够感染水貂引起病毒性肠炎,给实际生产造成重大经济损失,严重威胁着我国乃至世界水貂养殖业。目前对MEV的研究主要集中于病毒病的诊断、防治及疫苗研制,而对其感染宿主细胞的分子生物学机制则研究得较少,至今还未见MEV病毒蛋白质磷酸化修饰研究的报道。本课题选择MEV为研究对象,利用本实验室已建立的MEV反向遗传学操作系统,开展了一系列研究,获得了如下研究结果：首先,利用电镜观察、滴度测定等传统病毒学研究方法,结合PCR、Western blot等分子生物学方法,对MEV的形态、MEV感染F81细胞的生长曲线、隐蔽期等进行了研究,结合生物信息学方法分析了MEV VP2蛋白的结构和特性,为后续实验提供了理论依据和指导。同时还制备了兔抗MEV高免血清,并采用间接ELISA方法测定其效价为1：512000。其次,分析鉴定了MEV VP2蛋白可能的磷酸化氨基酸位点。使用NetPhos 2.0 Server分析VP2蛋白氨基酸序列,预测了24个可能的磷酸化位点；同时利用真核表达系统表达纯化了VP2蛋白,使用质谱方法检测到了4个可能的磷酸化位点。两种方法均检测到了Ser221位点的磷酸化修饰。使用生物信息学软件模拟VP2蛋白的三级结构,进一步确定了需要研究的磷酸化氨基酸位点并制定了突变方案。按照突变方案,利用基因定点突变技术,在己构建的MEV感染性克隆pB-MEV中引入相应位点的突变,共获得了21个含单位点或多位点突变的MEV感染性克隆。利用脂质体转染F81细胞,进行突变体病毒的拯救及鉴定,最终共拯救获得了7株突变体MEV。最后,结合病毒学和分子生物学方法,测定了突变体MEV病毒的滴度、生长曲线及感染F81细胞后基因组复制和VP2蛋白的表达情况。结果显示,与MEV-WT相比,MEV-S221A的生长曲线有较大差异,在感染后36 h,病毒滴度突然出现下降,随后虽有一定的升高,但至96 h时其滴度最高值仍然较低,比MEV-WT低了两个数量级。分子生物学方法检测结果表明,Ser221位点的突变并未影响MEV-S221A的基因组复制及VP2基因的表达。本文首次对MEVVP2蛋白的磷酸化修饰进行了分析鉴定,初步证明VP2蛋白Ser221位点在感染过程中能够被磷酸化修饰,进而影响了子代病毒衣壳装配过程或装配后的成熟过程,从而调控病毒的增殖。本研究不仅对探讨MEV增殖过程的分子机制及致病机理具有重要价值,同时为防治MEV所引起的疾病,提供了新的理论参考和依据。
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【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65

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