酵母端粒酶延伸端粒DNA分子机制的研究
本文关键词：酵母端粒酶延伸端粒DNA分子机制的研究 出处：《西北农林科技大学》2016年博士论文 论文类型：学位论文
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【摘要】：端粒酶是由一种蛋白质逆转录酶(TERT)和一个RNA亚基(TR)组成的,是一种特殊的逆转录酶(RT)来维持真核细胞染色体两端的端粒重复序列添加串联。端粒酶一个典型的特点区别于其他的逆转录酶RT是其精确和重复复制指定区域的RNA亚基的能力。以前的研究已经表明,RNA模板上游的某个不固定区域决定着模板的边界。在这项研究中我们利用高度纯度化的假丝酵母TERT与端粒RNA在体外重新组装成有功能的大分子复合体。令人惊讶的是我们发现这个重组端粒酶显示出几个意想不到的性质。首先作为一种有逆转录功能的酶只需要端粒RNA模板区域,它不需要端粒RNA其它二级结构和序列的支持。第二,DNA合成受到镶嵌在端粒RNA模板区两个固定核酸的调控,即延伸信号停止在rC~(261)-rC~(262)两个核苷酸之前。第三,一旦端粒DNA的延伸超过rC~(261)-rC~(262)两个核苷酸,会启动一个打开RNA径环的过程。最后更令我们惊讶的是假丝酵母TERT能够用非TER-RNA模板来调节非端粒DNA的延伸,因此我们发现假丝酵母TERT具有一个典型的逆转录酶的功能。本研究中的假丝酵母端粒RNA的重复序列有23个碱基,不像哺乳类端粒酶只有6个重复碱基。那么端粒酶在启动第二轮延伸时,23个已经配对的碱基是如何被打开也是我们关心的重要问题,有文献报导假丝酵母Pif1在撞击端粒酶然后行使解旋酶的功能,从而进行第二轮延伸,我们在研究中意外的发现假丝酵母Pif1(Capif1)具有3’-5’外切的活力。最近的研究中频繁的发现聚合酶,解旋酶具有3'-5'外切酶的活力,研究中我们分析了Pif1家族从细菌到人类的基因序列,发现一些序列保守的物种不但具有解旋活力还具有外切活力。而这个外切活力的序列不与解旋的活力中心在同一区域,各自执行着不同的功能。我们通过突变两个保守金属结合位点,使酸性氨基酸“E”突变成中性的氨基酸“A”后,CaPif1的外切活力基本丧失,这使得我们更加确定CaPif1不仅有解旋酶的功能,同时还具有外切酶的能力。同时我们根据同源序列的比较又找出8个物种的Pif1蛋白,发现其中细菌(BsPif1),人(hPif1),热带假丝酵母(CtPif1),啤酒酵母(ScPif1)(极弱),并没有外切酶活力。而热带念珠菌(MgPif1),范氏酵母(VpPif1)和杜氏假丝酵母(Cd Pif1).展现出了外切酶活力。新活力的发现让我们从新考虑Pif1在细胞内发挥的作用,切除掉端粒酶在聚合中出现的错配碱,或者端粒末端形成发夹结构以保护端粒DNA被切除等。以上这些新的发现为研究端粒酶聚合并修正错配的DNA分子时的作用机制提供了新的见解。
[Abstract]:In this study , we found that the recombinant telomerase reverse transcriptase ( RT ) is a special reverse transcriptase ( RT ) . It is a special reverse transcriptase ( RT ) to maintain the ability of RNA subunits in the designated region of eukaryotic cells . These new findings provide new insights into the mechanism of telomerase polymerization and the modification of mismatched DNA molecules .
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78
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，本文编号：1392303
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