鲤钙蛋白酶基因家族克隆表达及与肌肉质构相关性研究

发布时间：2018-01-09 23:27

本文关键词：鲤钙蛋白酶基因家族克隆表达及与肌肉质构相关性研究　出处：《哈尔滨工业大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：钙蛋白酶家族是与肉质科学相关最广泛的蛋白质水解酶之一,该酶是导致肌肉蛋白质水解,引起肉类嫩度改变的关键酶。钙蛋白酶家族是一个复杂的调控蛋白家族。钙蛋白酶(calpain,CAPN)和钙蛋白酶抑制蛋白(calpastatin,CAST)基因已被作为影响肉嫩度的候选基因,应用在动物育种、养殖以及动物屠宰后肉产品的嫩度的鉴定和嫩化等生产中。关于鲤capn基因家族与肌肉嫩度之间的关系尚未见文献报道。本研究采用同源克隆法对鲤CAPN家族主要基因进行克隆并进行生物信息学分析,应用荧光定量PCR技术对capn基因家族在组织、胚胎和成鱼肌肉内的表达量及与肉质性状进行相关分析,明确了capn基因家族同生长及肉质性状间的关系,为进一步通过该基因家族开发已知功能的分子标记,加快鲤肉质优良新品种的选育进度提供理论支持,为该基因家族的表达调控指明方向。采用同源克隆法获得了鲤capn1、capn2a、capn2b、capn3和cast基因完整的c DNA序列,其在Genbank登录号分别为KP878555、KF669387、KF669386、KF669385和JX275386。鲤capn2a和capn2b基因同斑马鱼capn2基因间同源性达到90%和85%。鲤和斑马鱼capn3基因间同源性达到89%,而鱼类的这两个分枝间的同源性为69%。鲤和草鱼cast基因氨基酸序列同源性为88%。capn基因家族系统进化树上所显示的亲缘关系也与传统的分类学较为一致。利用在线蛋白质特性分析软件分析了鲤CAPN蛋白家族,分析结果表明CAPN蛋白家族为亲水性蛋白,存在跨膜区,是潜在的跨膜蛋白。CAPN蛋白家族不含有信号肽序列,CAPN1蛋白亚细胞定位于线粒体,CAPN2和CAPN3蛋白的亚细胞定位于细胞质,CAST蛋白定位于细胞核。CAPN蛋白家族均含有磷酸化位点,CAPN1蛋白P52和CAPN3蛋白D627属于不常见磷酸化位点。CAPN蛋白均存在N-连接糖基化位点而无O连接糖基化位点。CAST蛋白含有1个N-连接糖基化位点和36个O-连接糖基化位点。由于糖基化位点预测时未发现信号肽特征,36个潜在的O-糖基化位点并不能进行糖基化。利用在线蛋白质结构预测软件对鲤CAPN蛋白家族结构预测表明,CAPN蛋白家族含有3种二级结构,包括α-螺旋、无规则卷曲和延伸链。鲤CAPN蛋白的三级结构为不规则球状结构,各蛋白在结构域I上有区别。鲤CAST蛋白三级结构为链状结构。鲤CAPN蛋白具有典型四个结构域,但CAPN3蛋白不含有3个典型的插入区域。CAST蛋白酶含有4个重复保守结构域,结构域之间的一致性达到44.02%。利用荧光定量PCR技术对capn基因家族进行的定量分析发现,capn基因家族在鲤8种组织中都有表达,各组织中的表达量因组织不同存在较大差异,含肌纤维组织内的表达量相对较高。在鲤囊胚期、体节期、咽胚期、出膜期和摄食期均有表达,但其时序表达量差异明显,鲤胚胎期capn3和cast呈负相关关系。capn基因家族在肌肉内的表达量存在相关,cast基因对capn基因的抑制作用最明显的是capn1基因,而对capn2和capn3的作用不明显。capn1基因与鲤体重、体宽和水分含量呈正相关,且与水分之间为显著正相关。capn3基因与灰分会呈正相关关系。cast基因与蛋白质和脂肪含量为正相关,与其他指标均为负相关。通过提取获得的CAPN蛋白家族的量与荧光定量PCR检测得到的该蛋白家族的相对表达量变化趋势基本一致,CAPN3和CAST蛋白的表达量显著高于CAPN1和CAPN2蛋白。利用物性测试仪检测鲤肌肉质构发现,冷冻能够大大延缓鱼类肌肉品质的改变,且温度越低品质下降越慢,-80℃冻藏鲤肌肉质构要略高于-20℃。水分与粘附性显著正相关,体重与黏聚性、胶黏性和咀嚼度显著正相关,体宽与咀嚼度显著正相关,蛋白质与肌肉恢复力显著正相关。capn基因家族与肌肉质构存在相关性,除了capn2b与黏聚性为显著负相关外,capn1与黏附性、capn2a与恢复性、capn2b与硬度、capn3与咀嚼度以及cast与黏聚性均呈现出强相关性。因此,鲤capn基因家族可作为肉质嫩度性状的候选基因。为进一步改善鲤肌肉品质,可以应用capn基因家族的基因序列开发SNP分子标记,进行肉质优良鲤新品种选育。同时,也可以调控capn基因家族的表达,降低CAPN蛋白的水解作用和CAST蛋白抑制作用,达到促生长和改善肌肉品质的目的。
[Abstract]:Calpain ( CAPN ) and calpastatin ( CAST ) gene have been cloned and analyzed by homologous clone method . The sequence of capn2a , capn2a , capn2b , capn2a and capn2b gene has been cloned and analyzed . The expression of capn gene family is positively correlated with the content of capn2b and capn2a . The results show that the capn gene family has positive correlation with the content of protein and fat .

【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4;Q78

【相似文献】