水貂阿留申病毒的分离鉴定和五种核酸疫苗的构建及免疫原性研究

发布时间：2018-01-10 01:05

本文关键词：水貂阿留申病毒的分离鉴定和五种核酸疫苗的构建及免疫原性研究　出处：《吉林农业大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：水貂阿留申病(Aleutian disease,AD),是由水貂阿留申病毒(Aleutian disease virus,ADV)引起的水貂免疫系统紊乱,同时并发自身免疫系统混乱的一种慢性、传染性病毒疾病,又称为浆细胞增多症。水貂阿留申病因其独特的致病机理和免疫机理,造成水貂阿留申病的免疫预防成为世界性的难题,至今尚未研制出有效的疫苗,给水貂养殖业造成巨大的经济损失。为此,本研究在对我国水貂阿留申病毒流行株分离鉴定的基础上,对分离毒株进行全基因组测序分析;筛选候选毒株,对其关键位点进行定点突变,构建全基因突变核酸疫苗;在实验室前期工作的基础上,构建ADV NS1全长基因、ADV NS1截短基因、ADV VP2全长基因和ADV VP2截短基因四种核酸疫苗;将构建的五种核酸疫苗免疫小鼠和本动物水貂,系统的监测所构建核酸疫苗的免疫原性,并分析ADV NS1全长基因核酸疫苗与ADV VP2全长基因核酸疫苗相互作用免疫效果。本论文将为破解水貂阿留申病尚无有效防制疫苗的难题,做出有益的探索。对采自我国疑似阿留申病而死的水貂内脏进行病毒分离,通过PCR鉴定及动物回归实验,确定共获得5株水貂阿留申病毒分离株,分别命名为ADV-DL124、ADV-DL125、ADV-JL3、ADV-QD2和ADV-QD3;应用免疫过氧化物酶单层细胞实验对所分离的ADV进行检测及TCID50测定。结果表明:ADV-DL124、ADV-DL125、ADV-JL3、ADV-QD2和ADV-QD3的TCID50分别为105.7 TCID50/ml、105.0 TCID50/ml、104.6 TCID50/ml、105.2TCID50/ml和104.1 TCID50/ml;根据Genbank上公布的不同ADV毒株基因序列,设计并合成12对引物,对所分离的病毒进行全基因扩增和测序。结果表明:ADV-DL124、ADV-DL125、ADV-JL3、ADV-QD2和ADV-QD3的基因组全长分别为4476bp、4538bp、4572bp、4569bp和4566bp;将分离毒株与ADV参考毒株以及细小病毒亚科各属代表种的全基因序列进行核苷酸序列分析及同源性比较。结果表明:ADV-QD3株与ADV-SL3株同源性最低,为92.8%。ADV-JL3株与ADV-U株同源性最高,为96.8%。对病毒分离鉴定和动物回归实验的结果进行综合分析,选取毒力较强的ADV-DL125株为候选毒株;应用重叠延伸PCR技术,定点突变ADV-DL125株VP2基因352、395和534位点的氨基酸,构建全基因突变核酸疫苗pcDNA3.1-ADV;同时,构建ADV NS1全长基因、ADV NS1截短基因、ADV VP2全长基因和ADV VP2截短基因四种核酸疫苗;通过间接免疫荧光及Western-blot实验,验证本实验所构建的五种核酸疫苗具有良好的反应原性;将构建的五种核酸疫苗免疫小鼠,通过检测小鼠体液免疫水平和细胞免疫水平的变化,表明构建的五种核酸疫苗能够刺激机体产生显著体液免疫反应,同时能够增强机体的细胞免疫应答水平。将构建的五种核酸疫苗及pcDNA3.1-NS1与pcDNA3.1-VP2核酸疫苗相互作用免疫水貂,并在ADV攻毒后,每隔14天监测水貂血清中γ球蛋白含量及外周血淋巴细胞中CD8+细胞含量。结果表明:与PBS空白对照组相比,构建的核酸疫苗pcDNA3.1-ADV及pcDNA3.1-VP2+NS1免疫后的水貂,能够引起机体产生ADV抗体,且外周血淋巴细胞中CD8+细胞含量较低。在ADV感染机体后,该两组血清中γ球蛋白及抗原抗体复合物的含量相较于其他各个实验组最低,表现出了良好的疫苗潜质。
[Abstract]:On the basis of isolation and identification of mink Aleutian disease virus ( Aleutian disease , AD ) , four kinds of nucleic acid vaccines of mink Aleutian disease virus were identified . The nucleotide sequence analysis and homology comparison of five kinds of nucleic acid vaccines were carried out . The results showed that the whole length of the genomic DNA vaccine was 4476bp , 4538bp , 4572bp , 4569bp and 4566bp .

【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65

【参考文献】