FAK对不同分化状态的神经干细胞定向迁移的调控研究

发布时间：2018-01-10 05:06

本文关键词：FAK对不同分化状态的神经干细胞定向迁移的调控研究　出处：《苏州大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：神经干/祖细胞(Neural stem/progenitor cells,NSCs)的迁移对哺乳动物神经系统的发育和损伤修复至关重要。许多神经退行性疾病的发生是由于NSCs迁移缺陷导致的,所以激发内源或外源移植的NSCs向神经损伤部位的迁移,是治疗神经性疾病的关键因素。我们的前期研究已表明,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)诱导的NSCs趋化迁移与其分化状态、粘着斑(focal adhesion,FA)动态变化及肌动蛋白(F-actin)细胞骨架重塑相关。粘着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)作为胞质酪氨酸激酶,在生长因子介导的信号通路及细胞迁移过程中起着关键作用,然而其在NSCs的趋化迁移过程中的作用还未被知详。本实验研究将探讨在不同分化状态的NSCs趋向VEGF的迁移过程中,FAK对FA的动态变化和分布的调控作用,及其与PI3K/Akt、MAPKs和Rac1信号通路之间的相互调节机制。利用C17.2 NSCs进行趋化迁移实验发现,PF573228(FAK抑制剂,简称PF-228)抑制FAK活性后,显著抑制了VEGF诱导的不同分化状态的细胞趋化迁移:Boyden chamber群体细胞迁移实验,未分化、分化1 d和分化3 d的NSCs的迁移数量均减少;Dunn chamber单细胞趋化迁移实验,未分化和分化1 d的NSCs向VEGF的趋化迁移明显受抑,细胞的迁移速度降低,迁移持续性也下降。另外,PF-228显著抑制VEGF诱导的胎鼠大脑皮层神经球和大鼠SVZ神经球的铺展及迁移,神经球的铺展半径减小,细胞迁移的速度也降低。FA在细胞迁移过程中呈不断形成-解聚的动态周转状态,FAK可以通过影响FA的形成及动态组装从而调控细胞迁移。免疫荧光染色发现,细胞在VEGF诱导下易伸出伪足,胞内的微丝结构发生重塑。许多小斑点样的FA在片状伪足处形成,FA的总数量增加。而在PF-228作用下,FA总数量减少,新生FA比例下降,成熟FA比例增加,说明不仅FA的形成受到抑制,而且成熟FA的解聚也受阻。并且在PF-228作用下,VEGF促进的p Y397-FAK和p Y31/p Y118-paxillin的磷酸化作用显著下调。细胞迁移至划痕区域过程中,VEGF诱导的新生FA主要分布在铺展的片状伪足处,前后FA极性分布比例较大,而PF-228处理后,成熟稳定的FA仅局限分布在细胞边缘。相应的,活细胞跟踪观察FA动态变化发现,VEGF显著提高了FA的周转速度,FA的组装加快,在细胞迁移前端不断形成小斑点FA,细胞尾端的FA也快速解聚;而PF-228作用下,细胞周边的FA斑点较大,周转缓慢,细胞尾端的FA解聚也较慢。转染FAK活性突变体发现,p RKGFP-FAK能够响应VEGF的刺激,FA数量变多,长度变短,而FAK-Y397F失活型指示的FA显著长于p RKGFP-FAK指示的FA,并且不响应VEGF的刺激,FA没有变化。说明FAK的Y397位点的活化在FA动态变化中起着关键作用。PF-228抑制FAK活性后,不同程度的抑制了PI3K/Akt和MAPKs信号通路的下游分子,包括Akt、ERK1/2、SAPK/JNK和p38MAPK的磷酸化作用,所以FAK影响细胞迁移及FA形成可能与PI3K和MAPKs信号转导通路有关:抑制PI3K/Akt或MAPKs信号通路,不同程度的阻碍了大鼠SVZ神经球的迁移及VEGF诱导的细胞迁移,特别是ERK1/2和SAPK/JNK信号通路显著长效的抑制了神经球的铺展;不同分化状态的FA形成也受到不同程度的抑制;划痕迁移过程中,细胞不具明显的极性形态,细胞前后端FA的极性分布比例也降低;Western blot也发现,VEGF诱导的FAK和Y31/118-paxillin的磷酸化也减弱,说明在细胞迁移及FA动态周转过程中,FAK与PI3K/Akt和MAPKs通路之间可能是相互调节的作用机制。最后,我们检测了调控F-actin细胞骨架的Rac1-GTPase在VEGF诱导的细胞迁移和FA形成中的作用。过表达Rac1激活型突变体Rac1-Q61L和Rac1-G12V,细胞趋化迁移的效率显著升高,片状伪足的伸展具有方向持续性,并且FA的数量显著增多。而转染Rac1显性阴性突变体Rac1-T17N,FA的数量较少,说明活化的Rac1促进FA形成,失活的Rac1抑制FA形成。在VEGF刺激下,p IRES2-GFP对照细胞和Rac1野生型细胞中的FA增加,而Rac1-Q61L和Rac1-G12V的细胞中的FA数量没有进一步增多,Rac1-T17N的细胞也不响应VEGF的刺激,说明VEGF诱导的FA形成过程中需要Rac1的活化。另外,FAK抑制剂作用下,无论是Rac1野生型还是Rac1激活型细胞中的FA形成均受到抑制,说明Rac1参与调控FA的形成最终还是需要通过FAK的活化。综上所述,通过本实验研究,我们明确了FAK在不同分化状态的细胞迁移中的作用,弄清了FAK对FA动态周转的调控机制,及其在此过程中与PI3K/Akt、MAPKs和Rac1信号通路相互作用的机制,为更好的调控细胞迁移提供有力的证据。
[Abstract]:The migration of neural stem / progenitor cells in the neural stem / progenitor cells is very important for the development and repair of the nervous system in mammals . At the same time , there was a significant increase in the phosphorylation of FA at the front and back of the cells . The effect of PF - 228 on the migration of VEGF and the phosphorylation of p38MAPK were observed . In the presence of VEGF , the number of FA in Rac1 - GFP - control cells and Rac1 - G12V cells was inhibited . The mechanism of the interaction between Rac1 - Q61L and Rac1 - G12V was demonstrated .

【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R329.2

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