两株携带v-fps和v-src肿瘤基因的复制缺陷型急性致瘤病毒的鉴定及其感染性克隆的致肿瘤作用

发布时间：2018-01-31 22:25

  本文关键词： 复制缺陷型病毒 急性致瘤性ALV v-fps肿瘤基因 v-src肿瘤基因 感染性克隆 致病性和致瘤性 转录组 拉米夫定　出处：《山东农业大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：近几年来,我国鸡群中J亚群禽白血病病毒(Subgroup J avian leukosis virus,ALV-J)诱发的髓样细胞瘤/血管瘤广泛流行的同时,在一些蛋鸡鸡群及“817”肉杂鸡鸡群中,出现了一定比例的体表纤维肉瘤。人工造病试验表明,接种了肉瘤研磨液的鸡在10-14d可发生相同类型的肉瘤,证明这些肉瘤为急性肿瘤(王鑫等,2012;刘绍琼等,2012;李传龙等,2012;李德庆等,2013)。本实验室前期工作中,以“817”肉杂鸡肉瘤组织DNA为模板,扩增到五种携带不完整v-fps肿瘤基因的缺陷型病毒基因组(Chen et al.,2012)。在此基础上,本研究将“817”肉杂鸡颈部皮下肉瘤和海兰褐蛋鸡肠系膜纤维肉瘤的研磨液接种鸡胚成纤维细胞(chicken embryo fibroblast,CEF),鉴定了两株急性致瘤性ALV所携带的v-fps和v-src肿瘤基因;构建了辅助ALV和分别带有v-fps和v-src肿瘤基因的缺陷型病毒感染性克隆质粒,通过动物实验分析拯救病毒的致瘤性;将“817”肉杂鸡肉瘤研磨液接种SPF鸡,研究了该病毒的致病性和致瘤性;通过鸡急性肿瘤的动物模型,研究了核苷类抗HIV药物拉米夫定对ALV-J复制的抑制作用。本研究利用反向遗传学技术首次证明了携带完整v-fps肿瘤基因的缺陷性ALV可在ALV-J辅助病毒存在的条件下在鸡体内复制并诱发急性纤维肉瘤。同时,该研究也是急性纤维肉瘤天然病例中,携带v-src肿瘤基因的ALV-J相关复制缺陷型病毒的首次分离报道。1.“817”肉杂鸡急性肉瘤中急性致瘤性病毒的分离及其v-fps肿瘤基因的鉴定将“817”肉杂鸡肉瘤研磨液接种1日龄SPF鸡,在鸡体上传代。以第五代肿瘤组织DNA和感染了肿瘤研磨液的CEF DNA为模板,通过PCR扩增,拼接获得了缺陷型病毒Fu-J株的前病毒基因组序列。序列分析表明,Fu-J是一株携带完整v-fps肿瘤基因的复制缺陷型病毒,它以复制型ALV-J SDAU1005为辅助病毒完成自我复制,故将该病毒悬液命名为Fu-J(SDAU1005)。Fu-J编码137 kDa的P137gag-fps融合蛋白。使用大肠杆菌表达系统获得Fps原核蛋白和p19gag原核蛋白,以其制备鼠抗Fps单因子血清和鼠抗p19gag单因子血清。对感染了Fu-J(SDAU1005)病毒悬液的CEF做IFA和Western blot检测,结果表明,感染了Fu-J(SDAU1005)病毒悬液的CEF可以同时对ALV-J单克隆抗体、鸡抗ALV-J单因子血清和鼠抗Fps单因子血清呈现阳性反应。本研究完成了Fu-J株病毒的全基因组序列测定,为研究该病毒致瘤的分子机制奠定了基础。2.rfu-js感染性克隆的构建、病毒拯救和拯救病毒的致瘤性分析通过pcr扩增、酶切连接等方法,构建了辅助alv感染性克隆质粒pmd-sdau1005和六种携带不同长度v-fps肿瘤基因的缺陷型病毒感染性克隆质粒pmd-fu-j,pmd-fu-j1,pmd-fu-j2,pmd-fu-j3,pmd-fu-j4和pmd-fu-j5。将pmd-sdau1005和六种pmd-fu-js质粒分别按一定比例共转染cef,获得拯救病毒rfu-j(rsdau1005)、rfu-j1(rsdau1005)、rfu-j2(rsdau1005)、rfu-j3(rsdau1005)、rfu-j4(rsdau1005)和rfu-j5(rsdau1005)。将6种拯救病毒分别翅下接种1日龄spf鸡,发现仅接种rfu-j(rsdau1005)的鸡出现了肿瘤(2/10)。将2只鸡的肿瘤在1日龄spf鸡上持续传代。在传代过程中,肿瘤的生长速度逐渐加快。当传至第4代时,肿瘤生长速度与野毒诱发肿瘤生长速度基本一致。ifa和免疫组织化学方法证实该肿瘤组织对alv-j及fps抗体呈阳性反应。该研究表明,携带完整v-fps肿瘤基因的缺陷型alv确实可诱发急性肿瘤。3.海兰褐蛋鸡腹腔急性肉瘤中急性致瘤性病毒的分离及其v-src肿瘤基因的鉴定以海兰褐蛋鸡原代肿瘤组织dna和感染了肿瘤研磨液的cefdna为模板,pcr扩增获得了复制缺陷型病毒sj-1、sj-2、sj-3、sj-4、sj-5及辅助病毒sdau1102的前病毒全基因组序列。该毒株被命名为sj-1(sdau1102)、sj-2(sdau1102)、sj-3(sdau1102)、sj-4(sdau1102)和sj-5(sdau1102)。序列分析表明,辅助病毒sdau1102为j亚群alv,其gp85基因与中国蛋鸡分离株js09gy6同源性最高。sj-1~5均携带v-src肿瘤基因,它们具有相同的3’端src-env衔接位点,但5’端衔接位点差异很大。使用大肠杆菌表达系统获得p60v-src原核蛋白,以其制备鼠抗p60v-src单因子血清。以该血清为一抗,westernblot和免疫组化实验显示,感染了病毒悬液的cef及肿瘤组织中,均存在p60v-src蛋白过表达。构建了五种缺陷型病毒的感染性克隆质粒。将其转染cef,发现仅sj-1和sj-2感染性克隆质粒可表达p60v-src蛋白。sj-1~5(sdau1005)的分离及鉴定为为进一步研究alv与原癌基因重组和v-src基因致瘤机制奠定了基础。4.fu-j(sdau1005)病毒悬液对spf鸡的致病性和致瘤性研究本研究首先建立了分别针对alv-jgp85基因和v-fps基因的sybrgreeni实时荧光定量pcr方法,两个方法特异性好、灵敏度高,为研究fu-j(sdau1005)的复制动态及其致病性提供了可靠的检测方法。分别采用颈部皮下、腹腔和静脉注射三种方式,将fu-j(sdau1005)病毒悬液接种1日龄spf鸡,观察病毒的致病性和致瘤性。结果表明,三种接种方式均可诱发鸡的急性肿瘤,且所有肿瘤均为纤维肉瘤;颈部皮下接种组的鸡体内没有肿瘤生长,表明该急性肿瘤的转移性不强;所有接触传播组的鸡均未发现肿瘤生长,表明该急性致瘤性ALV不容易通过横向接触方式传播。从上述结果,可以推测疫苗免疫时重复使用污染的针头,可能是某些鸡场内病毒从一只患病鸡传给其他个体并发生急性肿瘤的原因。病毒的抗原定位实验表明:在发病鸡体内肿瘤组织中辅助病毒和缺陷型病毒拷贝数最高;缺陷型病毒的拷贝数与辅助病毒拷贝数存在相关关系。5.感染了Fu-J(SDAU1005)病毒悬液的CEF转录组研究为探讨Fu-J株病毒诱发细胞转化的机制,本研究采用基因芯片技术对感染了Fu-J(SDAU1005)病毒悬液的CEF转录组进行了分析。与单独感染SDAU1005的CEF相比,感染Fu-J(SDAU1005)病毒悬液的CEF中有1253个转录子发生了4倍及以上的差异表达。这些差异基因主要涉及细胞过程、代谢加工、生物学调节、定位和发育过程等反应。细胞信号通路分析法发现,这些差异基因主要参与了神经活性因子-受体相互作用、紧密连接、代谢信号通路、GnRH信号通路、VEGF信号通路、Wnt信号通路等。本研究获得的差异转录组数据为深入研究v-fps肿瘤基因的急性致瘤机制奠定了基础。6.拉米夫定抑制ALV-J复制和肿瘤生长的研究为研究核苷类抗HIV药物拉米夫定对ALV-J复制的抑制作用,首先将Fu-J(SDAU1005)病毒悬液接种体外培养的CEF,研究其对ALV-J复制的影响。结果表明,在1-4μg/ml的浓度范围内,拉米夫定可有效抑制辅助ALV和缺陷型病毒的复制。荧光定量PCR结果表明,拉米夫定可以抑制ALV反转录酶的活性。通过鸡颈部皮下肿瘤和腹腔肿瘤两种动物模型,研究了拉米夫定在鸡体内对ALV-J复制的抑制作用。结果表明,拉米夫定可以抑制辅助ALV和缺陷型病毒在鸡体内的复制、降低病毒载量,从而减缓鸡颈部皮下肿瘤的生长,延长腹腔攻毒鸡的生存时间并降低其死亡率。本研究为ALV的防控提供了新思路,但拉米夫定能否在鸡群中推广使用尚需进一步研究和论证。
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【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
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本文编号：1480146