蛋白质内含子介导的蛋白质剪接及应用

发布时间：2018-01-31 23:02

本文关键词： 蛋白质内含子蛋白质剪接蛋白质断裂脯氨酸外显子序列定向进化双纯化蓖麻毒蛋白涤纶织物抗静电　出处：《东华大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：蛋白质内含子(intein)是存在于前体蛋白中的一段氨基酸序列,它能够发生自我剪切,并通过肽键将两端的蛋白质外显子(N端外显子N-extein,C端外显子C-extein)连接起来,形成成熟蛋白质。蛋白质内含子根据结构特征可以分为三类,标准蛋白质内含子(canonical intein),微小蛋白质内含子(mini intein)和断裂蛋白质内含子(split intein)。其中,前两种蛋白质内含子介导蛋白质顺式剪接(protein cis-splicing),断裂蛋白质内含子被断裂成两部分,N端蛋白质内含子(IN,N-intein)和C端蛋白质内含子(IC,C-intein),分别位于两个阅读框架中,介导蛋白质反式剪接(protein trans-splicing)。蛋白质内含子在蛋白质研究、蛋白质工程及其它领域有广泛应用,例如,蛋白质内含子已应用于毒素蛋白的合成,目的蛋白的活性控制,基因治疗,蛋白质修饰、标记,蛋白质环化,蛋白质纯化等方面。本论文主要涉及蛋白质内含子通用性研究及应用。前四部分为蛋白质内含子通用性研究,后三部分为应用。分别为,蛋白质内含子Ssp Dna X在临近外显子中存在脯氨酸时的剪接研究;蛋白质内含子Ssp Dna X在剪接困难序列(KSCDKTH)中的剪接研究;定向进化提高蛋白质内含子Ter Thy X剪接活性的研究;进化前后蛋白质内含子Cne PRP8-S0及Cne PRP8-E-S0的比较研究;基于两个纯化标签的双纯化系统的应用;蛋白质内含子剪接蓖麻毒蛋白的应用;蛋白质内含子对涤纶织物抗静电整理的应用。本论文主要研究内容包括:1.在pMST系统中筛选三个剪接活性高的微小蛋白质内含子Ssp Dna X,Ter Dna E-3和Npu Dna E,将+2位突变为脯氨酸或者将-1位和+2位同时突变为脯氨酸,检测蛋白质内含子的剪接活性。研究结果发现,Ssp Dna X微小蛋白质内含子的剪接效率为100%。进一步将Ssp Dna X断裂成不同的断裂蛋白质内含子(S0,S1,S11),在体内(in vivo)和体外(in vitro)检测其剪接活性。当+2位或-1位和+2位同时为脯氨酸时,Ssp Dna X-S1/S11断裂蛋白质内含子在体内外都能够发生高效剪接。本文首次发现,当临近外显子中有脯氨酸时,Ssp Dna X的微小蛋白质内含子和S1/S11断裂蛋白质内含子能够高效剪接,这项发现使得蛋白质内含子的剪接不再受到脯氨酸的限制,可以将蛋白质内含子应用于含有脯氨酸的宿主蛋白中,同时为Ssp Dna X三维结构的研究提供了有用信息。2.将pMST中蛋白质内含子插入位点处的外显子突变为KSCDKTH序列,选用具有高剪接活性的断裂蛋白质内含子Ssp Dna X-S0/S1/S11和Ter Thy X-S0/S1/S11在pMST系统中尝试剪接。研究结果表明,Ssp Dna X-S0/S1/S11在体内外都有很高的剪接效率(~100%)。这一发现使蛋白质内含子的应用不再受KSCDKTH序列的限制,也为抗体的剪接合成提供可行性基础。3.在pKH系统中(卡那霉素抗性系统),通过定向进化将Ter Thy X微小蛋白质内含子的剪接活性提高到~100%,而且在三个位点都有100%剪接活性,说明获得的Ter Thy X不仅剪接活性提高,通用性也有所提高。定向进化是一种提高蛋白质内含子活性的简便、有效的方法,通过简单的随机突变及定向筛选获得高效剪接及通用性高的蛋白质内含子,可以高效剪接含有不同外显子序列的目的蛋白。同时可以通过DNA测序得知蛋白质内含子的突变氨基酸,将结果反馈到蛋白质内含子结构与剪接活性关系的研究中。4.在pMST系统中,将定向进化前后的S0型断裂蛋白质内含子Cne PRP8-S0(天然+1位为Ser)和Cne PRP8-E-S0(天然+1位为Ser)进行剪接效率、剪接动力学(+1位为Ser或Cys)以及N-cleavage和C-cleavage的比较研究。研究发现,进化后的Cne PRP8-E-S0比天然Cne PRP8-S0在剪接速率和剪接活性方面都更加优越,尤其是将天然+1位Ser突变为Cys时,Cne PRP8-E-S0表现出更强的适应性。天然Cne PRP8-S0和进化后Cne PRP8-E-S0的N-cleavage差别不大,而对于C-cleavage效率和速率,Cne PRP8-E-S0更占优势。本文通过比较天然Cne PRP8-S0及进化后Cne PRP8-E-S0,发现通过定向进化可以获得具有功能优势的蛋白质内含子,获得的Cne PRP8-E-S0不仅可以剪接更多的目的蛋白,而且由于其高效的C-cleavage速率和效率,还可以应用于蛋白质内含子断裂反应介导的蛋白质纯化中。此外,定向进化获得的Cne PRP8-E-S0比具有优越性能的天然断裂蛋白质内含子Npu Dna E更具优势(Cne PRP8-E-S0在+1位突变为非天然氨基酸时仍可高效剪接,而Npu Dna E剪接活性降低)。5.本文设计了一个双纯化方法,将SUMO纯化标签与Ssp Gyr B S11断裂蛋白质内含子联用,构建一个双纯化系统。双纯化系统的结构为,His6-SUMO标签位于目的蛋白质的N端,Ssp Gyr B S11N-CBD标签位于目的蛋白的C端,目的蛋白在整个融合蛋白的中间位置。研究结果表明,通过对麦芽糖结合蛋白(MBP)和硫氧还蛋白(Trx)进行双纯化,在6种诱导条件下,均得到了纯度高的MBP(纯度95%,2.5-5 mg/L)和Trx(纯度95%,4-8 mg/L),而且电喷雾电离质谱(ESI-MS)检测双纯化得到的Trx蛋白分子量的结果表明,经过双纯化的目的蛋白没有末端缺失,也没有标签残留。通过双纯化系统可以纯化得到高纯度的目的蛋白,同时解决了目的蛋白末端缺失的问题,用双纯化方法得到的蛋白质,可以应用于对蛋白质要求较高的研究中,例如,蛋白质组学研究。同时,双纯化系统的提出,也使蛋白质纯化方法上升到一个新高度,一次性解决目的蛋白纯度及末端缺失的问题。6.蛋白质内含子可以用于毒素蛋白的生产,本研究分为两部分。第一部分,改造Ricin A(突变氨基酸),使其为蛋白质内含子的高效剪接提供基础,并通过Ricin A蛋白量与毒性关系曲线,检测三种突变体是否仍然具有毒性。第二部分,在Ricin A中选取两个不同插入位点site1,site2,不改变外显子氨基酸残基(即不改变Ricin A的氨基酸),检测Cne PRP8E-S0断裂蛋白质内含子的剪接活性。研究结果,第一部分,获得Ricin A蛋白量与毒性关系曲线图以及改造后Ricin A毒性的检测方法,经检测,三个突变体都没有失去毒性。第二部分,发现Cne PRP8E-S0在位点site2处有轻微剪接活性(~31%)。本研究为蛋白质内含子在体外高效剪接Ricin A提供了一定的基础,也证明利用蛋白质内含子剪接Ricin A实现特异性杀伤肿瘤细胞的可行性。7.蛋白质内含子用于涤纶织物抗静电整理。涤纶织物由于其耐穿、易洗涤等优良性能,被广泛应用于服装等领域。但是其分子结构中缺少亲水基团,因而具有亲水性差、易产生静电等缺点。利用蛋白质内含子的反式剪接功能将麦芽糖结合蛋白(MBP)与硫氧还蛋白(Trx)剪接形成的亲水性融合蛋白MT对涤纶织物进行功能整理。附着在涤纶织物上的MT融合蛋白,其亲水基团暴露在织物表面,增强了织物的亲水性能,使织物表面的电荷逸散,从而使其半衰期明显降低,提高其抗静电性能。本文为深入研究蛋白质等天然生物资源对涤纶织物的天然蛋白化,进一步开发具有保健等新功能的涤纶织物面料奠定理论基础。
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【学位授予单位】：东华大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q51;TS195.5

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