微流控高通量生物分析：从单细胞到复杂生物微环境

发布时间：2018-02-05 01:05

  本文关键词： 单细胞分析 细胞微环境 高通量分析 琼脂糖芯片 表面润湿性芯片　出处：《华中科技大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：随着人类基因组计划的完成,生命科学进入了后基因组时代,为了进一步揭开生命的奥秘,所需的生物信息规模空前的爆炸。建立新一代高通量的生物分析技术是当今许多研究领域的迫切需求。建立高通量的生物信息获取技术将广泛应用于基因组学,蛋白组学,药物筛选,干细胞分化等诸多领域。然而生物信息的高通量获取依然是一个巨大的挑战,其挑战主要来自两方面：一方面是如何更精准地获取生物学信息,如单细胞信息；另一方面是如何从更为真实的复杂生物微环境中高通量地获取生物学信息。传统的高通量分析方法主要是基于流式细胞,微孔板检测器和点样仪。其局限性在于无法准确的记录单细胞的动态响应,并且不能重建复杂三维的细胞微环境。近年来,微流控芯片由于其精确可控,高通量,尺度与细胞组织相匹配等优点受到了广泛的关注。同时基于微流控芯片的高通量分析呈现多元化发展,以满足不同领域的需求。本文针对单细胞和复杂生物微环境的高通量分析,建立了基于琼脂糖水凝胶、表面润湿性图案化和PDMS微通道的三类微流控芯片。主要研究结果如下：(1)建立一种基于琼脂糖微流控芯片的高通量单细胞基因组损伤分析方法。该方法可以在一块芯片上同时检测多至10000个细胞的单细胞基因组损伤,在保证更好的重现性的前提下,通量上相比传统方法提高了一百倍。通过采用琼脂糖作为微流控芯片的加工材质,利用琼脂糖的超亲水特性自动进样细胞并在通道内自动排列形成单细胞阵列。随即包埋细胞于琼脂糖微流体芯片中,并裂解电泳,分离并检测损伤DNA。该方法同样可以用于单细胞DNA损伤修复的研究,可广泛应用于药物筛选和细胞毒性实验等领域。(2)建立一种自定义浓度梯度芯片用于高通量单细胞多药耐药性分析。该芯片所形成的浓度梯度由分配通道长短比例决定,与液体流速和驱动压力无关,该设计保证了浓度梯度形成的稳定性并简化了芯片设计易于集成化。该芯片可以在单细胞乃至单细胞器水平分析数百个的细胞的多药耐药性,可以实时监控单细胞的药物外流。更进一步的,该方法可以用于化疗增强剂的高通量筛选。(3)建立一种低成本,快速且便携化的细菌富集和检测装置。该芯片由琼脂糖材质加工而成,利用琼脂糖材质的超亲水性和水渗透性,自动进样细菌悬液于微通道中,由于该芯片通道末端封闭设计,细菌被富集收集于通道末端。该芯片最多可以实现细菌样品一千万倍的富集。在一百万倍富集的条件下,其细菌捕获效率高达90%以上。该方法被证实同样可以用于血液样品和尿液样品的富集检测。通过结合免疫荧光染色,该方法成功检测到了临床病人样品中感染的细菌。(4)建立基于三维梯形微流体通道的细胞密度梯度组装新方法,通过控制微流体通道不同区域范围内通道高度,在均一的细胞悬液通入微流体通道后,待细胞随重力沉降,便能形成细胞密度梯度。通过该方法组装细胞密度梯度可在10分钟内完成。基于该方法通过顺序组装可以组装成多细胞种类细胞密度梯度。通过改变三维微流体通道中单层通道的形状可以控制细胞密度梯度的图案化。该组装方法可以模拟真实组织中的细胞密度梯度,重建其细胞间相互作用。该细胞模型可以用于高通量研究该复杂细胞微环境下细胞的行为和功能,我们研究发现在不同细胞密度下对碲化镉量子点毒性的耐受性有不同的表现。(5)基于表面润湿性的异质性复杂生物微环境高通量组装平台,我们进一步提出了一种可以同时高通量组装数以千计异质性生物微环境的方法。采用该表面润湿性图案化芯片,最多可以在数秒内同时加工百万计的单一组分液滴/微凝胶阵列。通过对单一组分液滴阵列融合与分裂等操作,可以在10分钟内组装数以千记的异质性细胞微环境阵列。该方法可以精确控制阵列中每一个细胞微环境阵列中的物理信号(包括图案化,材料的机械性能等),材料组成,化学信号(化学浓度,和多组分化学因子空间分布)以及细胞间相互作用(细胞密度梯度以及多细胞种类空间分布与相互作用)。该方法可以做为一种高通量分析平台,广泛用于组织工程,药物筛选和干细胞研究等领域。(6)基于表面润湿性的异质性复杂土壤-微生物微环境高通量组装平台,我们将其命名为芯片微地球。采用该表面润湿性图案化芯片,最多可以在数秒内同时加工数万计的单一组分土壤微环境。也可以通过结合点样,在十分钟内加工几百个异质性的土壤异质性微环境阵列。我们可以精确控制土壤微环境中的图案化,土壤矿物质成分,土壤有机质含量和成分,土壤微生物菌落等。通过微流体芯片,可以精确控制土壤周围的化学微环境,其中包括离子强度,酸碱度等因素。我们接着在该土壤芯片模型上研究了土壤的动态组装过程,我们观察到均一性的土壤悬液在组装过程中,土壤有机质和细菌会组装至土壤微生物复合物的边缘和角落。其现象原理同咖啡圈效应,且该组装中的异质性分布与其土壤的矿物组成成分之间有着一定的规律。该芯片模型模拟的现象重建了真实土壤形成过程中组分异质性分布的过程,并证明了物理作用可以影响土壤异质性分布。接着我们利用该系统研究了土壤对微生物生长行为的影响,我们发现微生物的吸附生长在一定程度上与其土壤复合物的拓扑图案化有关,其细胞活性与土壤矿物组成成分有关。最后我们通过结合该方法与XPS技术,研究微生物对土壤的作用,发现微生物的代谢调节着微生物-土壤微环境中的碳氮循环。综上所述：本文提出了一种琼脂糖微流控芯片,该装置在无需外力驱动设备控制下,可自动组装单细胞阵列用于高通量单细胞基因组损伤分析,并扩展应用于细菌的富集和检测；本文建立了一种基于表面润湿性的微液滴芯片,该装置可以高通量地在数分钟内精确组装数千个多组分阵列化的异质性三维细胞微环境,并扩展应用于土壤微环境的精确组装与高通量分析；本文发展了基于PDMS通道结构的微流控芯片,该类芯片可以自定义地可控形成化学浓度梯度和细胞密度梯度,该类芯片首次实现了细胞密度梯度的图案化,被应用于单细胞药物外流动态过程的监控,化疗增强剂的筛选,和纳米材料的细胞毒性分析。本文的研究为高通量生物分析提供了更多可靠的平台技术。
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【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q81
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本文编号：1491674