组蛋白H2B单泛素化调控拟南芥响应盐胁迫反应中微管骨架解聚的作用机制

发布时间：2018-02-04 23:12

  本文关键词： 组蛋白H2B单泛素化 微管 酪氨酸磷酸化 MAPK 盐胁迫 拟南芥　出处：《中国农业大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：植物在生长发育过程中受到各种生物和非生物胁迫的影响。盐胁迫作为一种重要的非生物胁迫,是影响和制约农业生产的重要因素。植物在长期的进化过程中形成了一套完整的调控机制来适应环境胁迫。研究表明,组蛋白H2B单泛素化(Histone H2B monoubiquitination,H2Bub 1)参与调控植物体内多个发育过程以及对生物胁迫的应答反应,但目前关于H2Bub1参与植物抗非生物胁迫的研究还未见报道。本论文选用拟南芥野生型和H2Bub1功能缺失突变体hub1-4,hub2-2,hub1-4hub2-2,对H2Bub1在拟南芥响应盐胁迫应答反应中的作用及其信号转导机制进行研究。研究发现,盐胁迫下,H2Bub1功能缺失突变体表现出叶片失绿、根生长受到抑制和存活率下降等盐敏感表型;NaCl处理引起野生型中H2Bub1基因HUB1(Histone monoubiuitination 1)和HUB2的转录水平均发生不同程度的上调。表明,H2Bub1正调控拟南芥响应盐胁迫的应答反应。利用激光共聚焦显微镜观察盐胁迫下的微管骨架动态,发现H2Bub1功能缺失使微管解聚速度变慢,微管解聚程度减弱,证明H2Bub1调控盐胁迫反应中微管骨架的解聚过程。对H2Bub1调控盐胁迫反应中微管解聚的作用机制进行深入研究。通过Rea1-time PCR的方法定量分析基因表达,发现盐胁迫下H2Bub1的功能缺失抑制了酪氨酸磷酸酶基因PTP1(Protein Tyrosine Phosphatase 1),DsPTP1(Dual-Specificity Protein Tyrosine Phosphatase 1),MKP1(MAP Kinase Phosphatase 1),MKP2(MAP Kinase Phosphatase 2),IBR5(Indole-3-Butyric Acid Response 5)和PHS1(Propyzamide Hypersensitive 1)的表达,由此表明,盐胁迫中H2Bub1是酪氨酸磷酸酶基因的正调控因子。利用35S:PTP1/hub1-4和35S:MKP1/hub1-4株系观察到hub1-4突变体的盐敏感表型得到回复,微管动态分析也证明hub1-4突变体的微管解聚回复到与野生型相似。表明,PTP1和MKP1调控拟南芥抗盐胁迫反应中微管的解聚过程。酵母双杂交和双分子荧光互补实验证明,PTP1,MKP1与MPK3(Mitogen-Activated Protein Kinase 3),MPK6互作,且PTP1,MKP1调控MPK3和MPK6的活性。随后对盐胁迫下野生型和H2Bub1突变体中MPK3和MPK6的基因表达、蛋白水平和激酶活性进行分析,发现H2Bub1影响拟南芥对盐胁迫响应中MPK3和MPK6的活性。利用MPK3和MPK6的持续激活突变体MKK5DD进行盐敏感表型和微管动态分析,发现MKK5DD突变体更抗盐胁迫且微管解聚速度明显快于野生型,表明MPK3和MPK6的激活加快微管的解聚过程,进而影响拟南芥的抗盐胁迫能力。同时,通过药理学方法检测酪氨酸磷酸化对野生型和H2Bub1缺失突变体微管骨架的影响,结果显示,盐胁迫中,附加酪氨酸激酶抑制剂GN(genistein)可促使微管稳定,植株表现出盐敏感的表型,野生型表现更为明显;附加酪氨酸磷酸抑制剂PAO(phenylarsine oxide)可促使微管解聚,植株表现出更耐盐的表型,H2Bub1缺失突变体表现更为明显。进一步验证了酪氨酸磷酸化参与H2Bub1调控拟南芥盐胁迫应答反应中微管的解聚过程。微管骨架的结构和功能依赖于微管结合蛋白,其中,MAP65-1(Microtubule-Associated Protein 65-1)是研究较为深入的微管结合蛋白。本研究发现M4P65-1影响拟南芥抗盐胁迫反应中微管的解聚,更重要的是,参与调控随后的微管聚合过程。且荧光素酶互补实验发现MPK3,MPK6可能与MAP65-1互作。综上结果,H2Bub1调控拟南芥对盐胁迫的应答反应中微管的解聚。H2Bub1可能通过PTP(Protein Tyrosine Phosphatase)-MPK3/6的信号模式调控微管结合蛋白的磷酸化与去磷酸化,从而调控微管骨架的解聚,而快速的微管解聚对植物适应盐胁迫至关重要。本研究为阐明植物抗盐胁迫的分子机理提供新的理论依据,也补充了植物中H2Bub1抵抗非生物胁迫作用的研究空缺。
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本文编号：1491422