玉米逆境响应相关基因ZmUBP的功能鉴定与WRKY基因家族进化分析

发布时间：2018-02-10 01:59

  本文关键词： 玉米 ZmUBP家族蛋白 蛋白质互作 非生物胁迫应答 分子进化　出处：《安徽农业大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：玉米是我国种植面积最大的粮食作物。生物与非生物逆境胁迫严重影响玉米的产量和品质,抗逆育种已成为玉米遗传改良的重要方向,因此发掘和研究抗逆相关基因及其功能并进行分子育种,是培育抗逆新品种提高玉米产量和品质的一种有效途径。泛素特异性蛋白酶(Ubiquitin-Specific Protease,UBP)是一类广泛存在于真核生物中的保守性很高的蛋白,它们通过脱泛素化作用调节生长发育。在植物抗逆过程中,UBP蛋白也有着重要的作用,但迄今关于玉米中该蛋白基因家族的功能还未见报道。本研究通过对玉米基因组ZmUBP家族分析,克隆了玉米中UBP14, ZmUBP16a,ZmUBP16b和zmUBP16c,并对这些基因的功能进行了分析鉴定；同时对玉米及其他禾本科物种中抗逆相关的WRKY转录因子家族进行了分子进化的研究。获得了以下主要结果：1、蛋白质结构域分析表明,ZmUBP14和ZmUBP16a/b/c均含有UBP结构域。组织表达模式分析显示,它们在玉米生长的各个时期都普遍表达。不同的非生物胁迫处理下,ZmUBP16a,ZmUBP16b和ZmUBP16c能够响应脱落酸诱导、盐离子及重金属胁迫。通过构建ZmUBP14-GFP和ZmUBP16a/b/c-GFP载体并转化拟南芥,研究ZmUBP14和ZmUBP16a/b/c的蛋白定位,结果表明ZmUBP14-GFP融合蛋白定位在细胞核中,ZmUBP 16a-GFP,ZmUBP 16b-GFP和ZmUBP16c-GFP融合蛋白均定位在细胞膜上。2、通过构建ZmUBP16a,ZmUBPl6b和ZmUBP16c过表达载体,分别转化拟南芥ubp16功能缺失突变体,结果显示,这三个蛋白均能回补拟南芥ubp16功能缺失突变体的表型。在拟南芥中分别过表达玉米ZmUBP16a,zmUBPl6b和zmUBP16c,分析表明,ZmUBP16a,ZmUBP16b和zmUBP16c的过表达并不影响植株的抗盐性,在经100mM NaCl处理后,过表达植株的表型与空载体对照无明显差异；在0.5μM ABA的处理下,过表达植株的发芽率在比空载体对照低了约50%,过表达ZmUBP16a和ZmUBP16b的植株表现出对CdCl2明显的不敏感性;因此说明,过表达ZmUBPl6a,ZmUBPl6b和zmUBP16c能够提高了拟南芥对ABA的敏感性和对重金属的抗性。3、通过对抗逆相关基因的表达分析,发现逆境条件下,zmUBP16a, ZmUBP16b和ZmUBP16c过表达植株中的抗逆功能基因的表达水平显著提高,抗重金属相关基因如AtABCC1,AtABCC2和AtPCS在镉处理后表达量明显高于对照；ABA通路基因以及与ABA合成相关基因(如AtNCED3,AtMYB2,AtRD22)的表达量也明显高于对照植株,而不依赖于ABA的抗逆基因AtCBF表达量变化不大。结果表明,ZmUBP16α,ZmUBP16b和ZmUBP16c是通过ABA信号转导途径参与离子胁迫应答。4、为进一步确认ZmUBP16a在重金属胁迫下的作用机制,本研究选取了野生型以及ZmUBP16a过表达植株在金属镉处理前后的植株样品,进行高通量转录组测序,通过表达差异分析发现,zmUBP16a过表达引起的上调基因中,大部分为代谢相关基因,包括糖代谢、能量代谢、脂肪酸代谢、氨基酸代谢和核苷酸代谢,在重金属镉处理后,这些代谢相关基因在过表达和野生型植株中大多呈现下调表达。在过表达和重金属处理都能引起上调表达的有3个功能基因,其中AT1G05680是活性氧(ROS)和植物激素信号转导途径中有重要的作用的基因。5、通过构建ZmUBPl4过表达载体,并转化拟南芥ubp14功能缺失突变体。分析结果表明,过表达玉米ZmUBP14基因能够回补拟南芥ubp14功能缺失突变体的表型。利用Pull-down分析技术,发现ZmUBP14和玉米抗逆相关转录因子ZmTCP15a以及ZmTCP15b在体外存在互作；双分子荧光互补(BiFC)技术分析也表明,ZmUBP14分别和ZmTCP15a/b)在植物体内也存在互作关系。因此ZmUBP14可能是与ZmTCP15家族蛋白互作,在逆境应激反应的功能上协同发挥作用。6、在禾本科物种中,重要的抗逆基因家族WRKY转录因子第一亚家族的基因在染色体上呈现出串联复制,并存在着广泛的微共线性关系,54个包含WRKYI基因的37个区段一共可以组装成8个具有共线性的区段组；除此之外,选择压力分析表明,禾本科家族中WRKYI基因的进化历程中,纯化选择起主导作用。
[Abstract]:Maize is the largest crop planting area in China. Seriously affect the yield and quality of Maize to biotic and abiotic stress resistance breeding has become an important direction for maize genetic improvement. Therefore, explore and study the resistance related genes and molecular breeding, breeding new resistant varieties is an effective way to improve the yield of and the quality of maize. Ubiquitin specific protease (Ubiquitin-Specific, Protease, UBP) are widely distributed in eukaryotes is highly conservative protein de ubiquitination through the regulation of growth and development. In the process of plant stress, UBP protein also plays an important role, but so far on the protein gene corn in family function has not been reported. In this study, through the analysis of the maize genome was cloned in Maize ZmUBP family, UBP14, ZmUBP16a, ZmUBP16b and zmUBP16c, and the gene function Can be analyzed and identified; the corn and other gramineous species against the WRKY family of transcription factors related to molecular evolution were studied. The main results were as follows: 1, protein domain analysis showed that ZmUBP14 and ZmUBP16a/b/c contain UBP domain. Analysis showed that the expression pattern, they are in various stages of maize the growth of common expression. Different abiotic stress treatments, ZmUBP16a, ZmUBP16b and ZmUBP16c can response induced by abscisic acid, salt and heavy metal stress. Based on the ZmUBP14-GFP and ZmUBP16a/b/c-GFP vector and transformed into Arabidopsis thaliana, protein localization of ZmUBP14 and ZmUBP16a/b/c, the results showed that ZmUBP14-GFP fusion protein located in the nucleus, ZmUBP 16a-GFP, ZmUBP 16b-GFP and ZmUBP16c-GFP fusion proteins were localized in the cell membrane of.2, ZmUBPl6b and ZmUBP16c through the construction of ZmUBP16a expression vector The loss of function of ubp16, were transformed into Arabidopsis mutants. The results show that the three phenotypic protein were recovered in Arabidopsis ubp16 deficient mutants. In Arabidopsis thaliana were over expression of maize ZmUBP16a, zmUBPl6b and zmUBP16c analysis showed that ZmUBP16a overexpression of ZmUBP16b and zmUBP16c did not affect plant salt tolerance in 100mM NaCl after treatment, overexpression phenotype and empty vector control plants had no significant difference; in the treatment of 0.5 M ABA, the germination rate of overexpression plants than in the empty vector control is down about 50%, over expression of ZmUBP16a and ZmUBP16b plants showed obvious sensitivity to CdCl2; therefore, over expression of ZmUBPl6a. ZmUBPl6b and zmUBP16c can improve the sensitivity of Arabidopsis ABA and heavy metal resistance of.3, the expression of related genes against inverse analysis, found that under stress conditions, zmUBP16a, ZmUBP16b and ZmUBP16c. The expression level of expression in plant resistance genes significantly increased resistance to heavy metal related genes such as AtABCC1, the expression of AtABCC2 and AtPCS in cadmium treated were higher than that of the control; ABA pathway and ABA synthesis related genes (such as AtNCED3, AtMYB2, AtRD22) expression was significantly higher than that of control plants, but does not depend on ABA resistance gene AtCBF expression did not change. The results show that the ZmUBP16b and ZmUBP16 alpha, ZmUBP16c is through the ABA signaling pathway in response to.4 stress, to further confirm the role of ZmUBP16a in heavy metal stress mechanism, this study selected the wild type and ZmUBP16a overexpressing plants in plant samples before and after cadmium treatment, high throughput transcriptome sequencing, the expression analysis found that overexpression of zmUBP16a up-regulated genes induced in the majority of metabolism related genes, including glucose metabolism, energy generation Xie, fatty acid metabolism, amino acid metabolism and nucleotide metabolism in cadmium treated, these metabolic genes are down regulated in expression and in wild type plants. It can up regulate the expression of the expression and treatment of heavy metals has 3 functional genes, where AT1G05680 is the active oxygen (ROS) gene.5 and an important role in plant hormone signal transduction pathway, through the construction of ZmUBPl4 expression vector and transformed into Arabidopsis ubp14 deficient mutant. The analysis results show that the over expression of ZmUBP14 gene in maize can recharge phenotype of Arabidopsis ubp14 deficient mutant. By using Pull-down analysis technology, ZmUBP14 and maize transcription factor ZmTCP15a and ZmTCP15b in vitro interaction; bimolecular fluorescence complementation (BiFC) technology analysis also shows that ZmUBP14 and ZmTCP15a/b respectively) are also close interaction in plants Therefore. ZmUBP14 may be the interaction with the ZmTCP15 protein family, in adversity stress response function on the synergistic effect of.6, in the Poaceae species, important resistance gene WRKY family transcription factor subfamily I gene on a chromosome showing a tandem duplication, and the existence of microcolinearity is wide, 37 section 54 contains the WRKYI gene can be assembled into a total of 8 sections were with linear; in addition, the selection pressure analysis shows that the evolution of the WRKYI gene in the family Poaceae, purifying selection plays a leading role.

【学位授予单位】：安徽农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2

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本文编号：1499391