Bacillus acidopullulyticus普鲁兰酶可溶性高效表达及热稳定性分子改造

发布时间：2018-02-14 14:12

  本文关键词： 嗜酸普鲁兰芽孢杆菌 普鲁兰酶 大肠杆菌 可溶性表达 热稳定性　出处：《江南大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：普鲁兰酶是一种双向催化酶,能够催化普鲁兰多糖、淀粉等多聚葡萄糖类底物分支部位的α-1,6-糖苷键的水解,特定条件下也能催化α-1,6-糖苷键的反向合成,因而可应用于糖苷化合物分子结构解析、淀粉原料糖化以及功能性药用多糖合成等诸多领域。当前该酶被广泛地应用于淀粉糖工业中,成为高品质糖浆生产过程中的关键酶制剂。淀粉糖化过程需要在高温(60°C)下进行,糖化时间一般为48 60小时,普鲁兰酶必须具备在高温下保持较高酶活性和稳定性的能力,筛选耐高温普鲁兰酶对于淀粉糖化过程中降低使用成本和改进工艺具有重要意义。本论文以B.acidopullulyticus普鲁兰酶(Pul A)为研究对象,采用不同的宿主构建重组菌株,对比考察目标蛋白在不同表达系统中的表达情况,遴选适合于后续基础研究的表达系统,并通过过程参数优化、载体和宿主的试错组合以及分子精简等策略实现目标蛋白高效重组表达;依据结构生物学、生物信息学以及同源多序列比对分析结果,甄选与热稳定能力相关的关键氨基酸及结构模块,通过定点突变技术构建突变体,对比考察突变前后酶蛋白酶学性质差异,筛选和获得最适温度和/或温度稳定性优于野生型的热稳定突变体。主要研究结果如下:1.当采用p ET-22b(+),p ET-28a(+)表达Pul A时,酶活分别是29.7±0.6 U×m L-1和27.3±0.8 U×m L-1,是同等条件下p ET-20b(+)-Pul A的6.8倍和6.2倍。将p ET-22b(+)-Pul A质粒上的T7启动子置换成Tac启动子,可溶性表达量大幅下降,所表达的目标蛋白几乎全部以包涵体形式存在,上述结果表明菌体生长初始阶段的本底表达导致p ET-20b(+)-Pul A和p GEX4T2-Pul A大量形成包涵体,通过严谨控制本底表达水平可显著提高了普鲁兰酶在大肠杆菌中的可溶性表达水平。宿主方面,采用Rosetta(DE3)提高稀有密码子t RNA水平,可提高单位菌体的表达量。2.采用N端截短方式对Pul A进行分子精简,探索N端结构域对可溶性表达、胞外分泌以及其他酶学性质的影响。结果表明,缺失CBM41可有效提高可溶性表达量,X25结构域对可溶性表达量影响不明显,X45结构域可能在促进催化结构域正确折叠或维持催化结构域正确构象中发挥作用,缺失X45后目标蛋白主要以不溶的包涵体形式存在。缺失CBM41的变体可在pel B信号肽的引导下分泌至胞外,且胞外酶活上升部分是细胞自溶引起的。突变体M1(ΔCBM41),M3(ΔX25)和M5(ΔCBM41ΔX25)的最适温度(60°C)和最适p H(5.0)与野生型相同,三者对分子量较大底物(可溶性淀粉)的水解效率下降较明显,但对小分子底物(糊精)的水解效率影响较小,淀粉糖化结果表明切除CBM41和X25结构域的变体不影响其在淀粉糖化过程中的实际应用。3.采用四种计算机辅助理性设计方法(B-FITTER、Proline理论、Po PMu Si C-2.1和序列一致性)筛选出39个可能影响热稳定性的关键氨基酸位点。两轮定点突变后(单定点突变+迭代多点突变)获得热稳定性显著优于野生型普鲁兰酶的突变体Pul A-TS:60°C下的半衰期为387.3 min,是野生型的11倍;Tm值为74.5°C,较野生型提高了9.5°C。Pul A-TS最适温度为65°C,高于野生型5°C,突变体在较高的温度下具有较好的热力学稳定性及动力学稳定性。晶体结构分析结果表明,突变体热稳定性提高可能与518I位点较高的疏水作用和低自由能、662R位点引入两个新的氢键、706P位点较高的刚性以及更为紧凑的空间结构相关。4.将Pul A结构域B置换为G.thermoleovorans普鲁兰酶结构域B,构建嵌合突变体Pul A-GTPB。嵌合突变对菌体生长和可溶性表达量无影响,但Pul A-GTPB的比酶活力仅为野生型的43%。野生型和嵌合突变体的最适底物均是普鲁兰多糖,且对高度分支的糖原没有水解活性,但是突变体对普鲁兰多糖底物的亲和力(Km)下降,催化效率仅有野生型的51%,此外突变体对糊精和可溶性淀粉的水解活性较野生型有明显上升。与野生型相比,Pul A-GTPB最适p H由5.0上升至6.5,且在酸性环境中的稳定性低于野生型;最适温度由60°C上升至70°C,在60°C温浴30 min后的残余酶活由55%上升至95%;60°C下的半衰期由34.9 min上升至168.4 min;热力学稳定性测试结果表明,突变体解折叠一半时的温度为72.0°C,较野生型提高了7°C。
[Abstract]:鏅�椴佸叞閰舵槸涓�绉嶅弻鍚戝偓鍖栭叾,鑳藉�熷偓鍖栨櫘椴佸叞澶氱常�

本文编号：1510888