PARP1作用于RNA结合蛋白HuR调节炎症因子mRNA稳定性的机制研究

发布时间：2018-03-04 21:23

  本文选题：PARP1　切入点：PARylation　出处：《东北师范大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：聚ADP核糖化,即PAR化修饰((PARylation),作为体内重要的蛋白修饰过程主要由PARP家族中的PARP1介导发生。PARP1活化后通过对自身及其他蛋白的PAR化修饰参与到细胞的多种重要生物学事件中,如染色质的改构,细胞的凋亡,DNA的损伤修复以及基因表达调控等。近年来,PARP1在静息状态或各种刺激下调节基因表达的作用越来越引发人们的关注。陆续有研究报道了PARP1在转录后水平对基因RNA代谢的影响,如,在小鼠胚胎成纤维细胞中PARP1能够影响炎症因子IP-10 mRNA的表达,但具体机制没有被阐明;PARP1还能通过对poly(A)聚合酶的PAR化修饰参与mRNA前体poly(A)尾巴的形成。这些研究都提示了PARP1能够在转录后水平参与基因表达调控的可能性。转录后水平,尤其是mRNA稳定性的调节,主要由顺式作用元件和反式作用因子共同调节,顺式作用元件是指mRNA自身上的结构,如3’UTR,5’UTR,编码区等,反式作用因子是指那些与顺式作用元件结合的蛋白。炎症因子,细胞因子及一些原癌基因的mRNA皆为短命的mRNA,在其3’UTR含有一个AU富集的区域,被称为ARE元件。ARE元件被认为是mRNA上的不稳定因素,能被众多RNA结合蛋白结合,进一步招募外切体,介导mRNA的降解。ARE元件及ARE结合蛋白共同影响这些mRNA的功能及命运。其中ARE结合蛋白HuR,是为数不多已知的对mRNA起到稳定性的一类蛋白。HuR蛋白不同形式的翻译后修饰(如普遍关注的磷酸化修饰)被认为是影响HuR功能的重要分子机制。我们实验室前期的实验结果显示,PARP1能够与RelA/p65相互作用并对p65进行PAR化的修饰,进而促进NF-κB依赖的促炎相关炎症因子的表达。基于mRNA稳定性的调控能够提供简单,便捷又灵活的操控,炎症因子的表达一般都受到严格的转录以及转录后的调控。这促使我们决定进一步探究PARP1是否能够影响炎症因子及细胞因子mRNA的稳定性。在我们的实验体系中,利用脂多糖LPS刺激小鼠巨噬细胞或给小鼠滴鼻给药活化PARP1建立炎症模型,在PARP1抑制剂PJ34或3-AB存在的情况下探究PARP1在转录后水平对基因的重要意义。1)通过细胞因子-炎症因子矩阵实验,我们发现细胞内由LPS刺激引起的一系列促炎因子,包括Cxcl2 mRNA稳定性的升高均能够被PARP1抑制剂的加入显著抑制,证明了PARP1对于炎症因子mRNA稳定性的调节作用;2)利用双报告体系及干涉HuR并联合共转染PARP1的实验,证明了PARP1是通过RNA结合蛋白HuR作用与ARE元件进而影响mRNA的稳定性;3)进一步通过免疫共沉淀及体外激酶实验证明了PARP1与HuR的相互作用,以及对HuR的PAR化修饰,并且利用点突变证明了D226位点是HuR发生PAR化的主要位点;4)接下来免疫荧光实验证明了PARP1对于HuR核质穿梭的重要性;5)RNA凝胶阻滞实验及RNA-IP实验则说明了HuR的PAR化修饰能够促进HuR与靶mRNA的结合;6)最后,通过对炎症因子mRNA半衰期的检测,证实了HuR的D226位点对HuR的功能发挥起到重要的作用。这些结果都提示了一种新颖的机制,即PARP1能够通过对RNA结合蛋白HuR的PAR化修饰作用,在转录后水平(通过对mRNA稳定性的调节)参与基因表达的调控。
[Abstract]:Poly ADP nuclear saccharification, that PAR modification ((PARylation), as an important protein modification process in vivo by PARP1 mediated PARP Family Guide.PARP1 activation by PAR modification to itself and other proteins involved in many important biological events in cells, such as chromatin remodeling, cell apoptosis, DNA damage repair and gene expression regulation. In recent years, and the role of PARP1 in the resting state or under the stimulation of regulation of gene expression more cause the attention of people. Many studies have reported the effects of PARP1 on the level of gene, RNA metabolism such as transcription, PARP1 in fibroblasts can affect the expression of inflammatory cytokines IP-10 mRNA in the mouse embryo, but the specific mechanism has not been elucidated; PARP1 is also based on the poly (A) polymerase PAR modification in pre mRNA poly (A) tail formation. These findings suggest that PARP1 can in turn The possibility of regulation of gene expression level of participation in the post transcriptional level. After the record, especially in the regulation of mRNA stability, mainly by the factor of cis acting elements and trans acting co regulation, cis acting element refers to the structure of mRNA itself, such as the 3 'UTR, 5' UTR, encoding region, trans acting factor are those with cis element protein. Inflammatory factors, cytokines and some oncogene mRNA are short-lived mRNA, in the 3 'UTR contains a AU enrichment area, known as the ARE component of.ARE components is considered unstable factors on the mRNA, can be many RNA combined with protein, further recruit the exosome mediated degradation of.ARE components, mRNA and ARE binding protein influence function and the fate of mRNA. The ARE binding protein HuR, is one of the few known mRNA of a kind of.HuR protein to the stability of different forms of translation Post-translational modification (such as attention phosphorylation) is considered to be an important molecular mechanism affecting the function of HuR. Our previous experimental results show that PARP1 can interact with RelA/p65 and modified PAR of p65, and promote NF- kappa B dependent proinflammatory related inflammatory cytokines expression and regulation of mRNA. The stability can provide a simple and convenient based on flexible manipulation, the general expression of inflammatory cytokines are strictly transcription and post transcription regulation. This led to our decision to further explore whether PARP1 can influence the inflammatory cytokines and cells due to the stability of sub mRNA. In our experiment, using LPS in macrophages or to LPS mice administered intranasally activated PARP1 an inflammation model of PARP1 gene at the post transcriptional level of significance of the.1 in the presence of the PARP1 inhibitor PJ34 or 3-AB). Cytokine - inflammatory factor matrix experiments, we found that cells stimulated by LPS caused a series of proinflammatory cytokines, including Cxcl2 increased the stability of mRNA can be added to inhibit PARP1 inhibitors, proved that PARP1 for inflammatory cytokines mRNA stability regulation; 2) using dual reporting system and HuR and co transfected with interference PARP1 experiments proved that PARP1 is affecting the stability of mRNA RNA binding protein HuR and ARE elements; 3) further by CO immunoprecipitation and in vitro kinase experiments proved that the interaction between PARP1 and HuR, and the HuR PAR modification, and the use of point mutations that D226 locus is the main site of HuR PAR; 4) following immunofluorescence experiments proved that PARP1 is important for HuR nucleocytoplasmic shuttling; 5) RNA gel retardation experiments and RNA-IP experiments indicate that the PAR modification of HuR can promote The combination of HuR and target mRNA 6); finally, through the detection of inflammatory factors of the half-life of mRNA, confirmed the function of D226 HuR on HuR sites play an important role. All of these results suggest a novel mechanism, namely PARP1 through RNA binding protein HuR PAR modification effect at the post transcriptional level (by regulating the stability of mRNA) is involved in regulation of gene expression.

【学位授予单位】：东北师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q75

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本文编号：1567377