牛心朴子草逆境胁迫转录组分析与CkNF-YB1、CkEDS1的功能研究

发布时间：2018-03-05 19:52

  本文选题：牛心朴子　切入点：逆境胁迫转录组分析　出处：《中国农业大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：牛心朴子Cynanchum komarovii)是一种荒漠草本植物,具有杀虫、抑菌、抗植物病毒等生物活性,被用于制备绿色农药,其有极强的荒漠适应能力,在100mmm以下降雨量仍可存活,耐地面最高温度67-96℃℃、最低温度-29℃℃到-36℃℃,集耐早、耐高温、耐冷等抗逆性于一身,是获得抗逆优异基因的好材料。本论文研究目的是明确植物耐旱、耐低温的分子机理,在公共数据库中填补牛心朴子可利用的基因序列和遗传信息,为农作物耐旱、耐冷新品种培育提供基因资源。本文首次对牛心朴子逆境胁迫转录组进行分析,明确干旱、低温胁迫下牛心朴子差异表达基因,探究牛心朴子耐旱、耐低温的分子机制及其响应非生物胁迫的信号转导机理,挖掘新型耐旱、耐低温基因。本论文还研究牛心朴子耐旱基因CkNF-YB1、抗病基因CkEDS1的功能。主要研究结果如下：1、采用高通量Illumina HiSeq测序平台对干旱胁迫下牛心朴子进行转录组测序,获得27.5GB测序数据,组装得到148715条Unigene,平均长度为604bp,其中85106条在7大公共数据库比对中获得功能注释。KOG功能分类中有4364个Unigene与信号转导相关。KEGG生物代谢途径分析表明有29737个Unigene分别参与31个代谢途径,其中有827个基因被鉴定与环境适应功能相关,2840个基因与信号转导功能相关,426个基因与次级代谢产物的生物合成相关。在干旱胁迫下鉴定出3134个差异表达基因,其中上调基因601个。明确参与植物角质和蜡质生物合成的代谢途径具有最大Rich factor,参与此生物过程的基因富集程度高,统计鉴定出参与蜡质合成、转运及调节功能相关的差异基因26个。2、对低温胁迫下牛心朴子进行转录组测序,获得30.5GB测序数据,组装得到100006条Unigene,平均长度为649bp,其中有47082条Unigene在7大公共数据库比对中获得功能注释。KOG功能注释中1779个与信号转导机制相关的基因,以及有786基因被鉴定为与次生代谢合成、转运和分解功能有关。KEGG生物代谢途径分析鉴定出17695条Unigene参与转录、碳水化合物代谢、运输及分解代谢等,其中有445个基因被鉴定为与环境适应功能相关,305个基因与信号转导功能相关。在低温胁迫下鉴定出7742个差异表达基因,其中上调基因3081个和下调基因4661个。对差异基因的GO功能与KEGG代谢途径富集分析,植物激素信号转导和淀粉与蔗糖代谢为主要的生物过程。参与类黄酮生物合成、黄酮与黄酮醇生物合成途径具有最大Rich factor,表明在低温胁迫下参与类黄酮生物合成途径的基因富集程度高。对牛心朴子中响应低温应答差异基因分析,鉴定出550个转录因子,包括MYB、 C3H、bHLH、AP2-EREBP等转录因子。3、以干旱转录组数据为参考序列,从牛心朴子中克隆转录因子CkNF-YB1,在其根和茎中表达量高,受到ABA与PEG6000诱导表达。CkNF-YB1与GFP荧光蛋白构建融合表达载体,其表达定位于细胞核内。利用酵母单杂交技术验证单一的CkNF-YB1蛋白不具有转录激活活性。将CkNF-YB1基因转入拟南芥野生型与nf-yb突变体中。表型实验发现相对于野生型和突变体株系,过表达株系OE10和OE13在干旱胁迫条件下种子萌发率分别为76.00%和78.00%,含水量分别为65.50%和66.85%,相对电导率分别为36.56%和35.57%。耐旱相关基因的表达水平实验分析表明,CkNF-YB过表达转基因株系中RD29A、RD29B、CBF4和KIN1表达量高于野生型植株。实验证明CKNF-YB1提高了转基因植株在干旱胁迫条件下的耐受能力。4、以牛心朴子转录组数据为参考序列,从牛心朴子中克隆出CKEDS1,该基因在根和茎中表达量高,受SA诱导表达。将CkEDS1与GFP荧光蛋白构建出融合表达载体,其表达定位于细胞核。将CkEDS1转入拟南芥野生型与edS1突变体细胞中,对转基因株系在棉花黄萎病菌侵染下抗病情况分析,发现在21dpi时转CkEDS1基因株系的病情指数分别为19.44和22.77低于野生型(36.11),而28dpi时转CkEDS1基因株系的病情指数分别为42.78和42.22显著低于野生型(72.78)。抗病相关基因的表达水平分析表明,CkEDSl过表达株系中PR1、PR5和ICSl的表达量显著高于野生型。转CkEDS1基因棉花在田间表现出对黄萎病抗性。实验验证了CkEDS1能够提高转基因植物抗病能力。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2
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本文编号：1571643