甜菜素植物—红苋菜中过氧化氢酶—酚氧化酶的鉴定

发布时间：2018-03-10 05:00

  本文选题：红苋菜　切入点：甜菜素　出处：《中国农业大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：甜菜素是一组水溶性的含氮色素,包括甜菜红素和甜菜黄素。它主要位于石竹目植物中,替代了花青素,赋予这些植物五彩缤纷的艳丽色彩,并且广泛应用于食品、药品等行业。一般认为甜菜素生物合成途径起始于L-酪氨酸的羟基化。尽管PPO型酪氨酸酶被认为是参与此步反应的酶,但是目前仍然存在争论。本研究试图分离纯化能够羟基化酪氨酸的酶并且克隆其基因来解析甜菜素生物合成途径中的起始步骤。从甜菜素植物——红苋菜的叶片中通过切胶回收法分离纯化到一个电泳纯的酶。SDS-PAGE和Native PAGE分析揭示纯化的酶是一个三亚基蛋白,亚基分子量约为58 kDa。体外催化实验证明该酶既具有过氧化氢酶活性,又具有单酚酶活性(L-酪氨酸为底物)和双酚酶活性(L-DOPA为底物)。这三个酶活性各自的最适温度、最适pH和Km值不同：过氧化氢酶活性(20℃、pH 7.0和188mM)、单酚酶活性(60℃、pH 8.0和0.2 mM)和双酚酶活性(60℃、pH 8.0和0.6 mM。体外抑制分析揭示该酶的过氧化氢酶活性和酚氧化酶活性都可以分别被经典的过氧化氢酶抑制剂和经典的酪氨酸酶抑制剂(托酚酮除外)抑制。采用nano-LC-MS/MS对纯化的酶进行分析,得到5个置信度高的肽段。MASCOT分析证明这5个肽段序列都指向植物过氧化氢酶,其中包括两种甜菜素植物——冰叶日中花和盐地碱蓬的过氧化氢酶。参考上述甜菜素植物的过氧化氢酶基因序列设计兼并引物,通过RT-PCR和RACE克隆到一段1951 bp的cDNA序列,它包括一条编码492个氨基酸的完整的CDS。根据RACE cDNA序列,克隆了完整的CDS序列,两者编码的氨基酸序列完全相同。序列分析结果揭示：该CDS编码的多肽链中不但含有nano-LC-MS/MS分析得到的全部肽段序列,而且含有过氧化氢酶活性中心和酚氧化酶活性中心,因此将该酶命名为AcCATPO.将AcCATPO及己知的CATPOs的氨基酸序列与GenBank数据库中搜集到的植物过氧化氢酶序列进行比对分析后发现：这两个活性中心同样也存在于非甜菜素植物的过氧化氢酶中,这说明第四组过氧化氢酶在植物中普遍存在。为了初步验证AcCATPO在甜菜素生物合成途径中的作用,对普通苋菜叶片中绿色部分和红色部分的甜菜素含量与AcCATPO的mRNA表达水平的关系进行考查,观察到叶片绿色部分和红色部分中AcCATPO的转录物丰度与甜菜黄素对甜菜红素的比率之间呈正相关,这暗示AcCATPO可能主要参与甜菜黄素的生物合成途径。以上结果表明：第四组过氧化氢酶,即过氧化氢酶-酚氧化酶,也普遍存在于植物中,并且有可能参与了甜菜素植物中甜菜素生物合成途径中酪氨酸的羟基化。在植物中,第四组过氧化氢酶的成功鉴定为研究这类酶在植物体内的功能,尤其在甜菜素生物合成途径中的功能打开了一个窗口。
[Abstract]:Betaine is a group of water-soluble nitrogen-containing pigments, including betaine and berelin. It is located mainly in carnation plants, replaces anthocyanin, gives these plants colorful colors, and is widely used in foods. Industries such as pharmaceuticals. The betaine biosynthesis pathway is generally thought to originate from the hydroxylation of L-tyrosine. Although PPO tyrosinase is thought to be the enzyme involved in this reaction, However, there is still controversy. This study attempts to isolate and purify the enzyme that can hydroxylate tyrosine and clone its gene to elucidate the initial steps in the biosynthesis pathway of betaine. A pure enzyme, SDS-PAGE, and Native PAGE analysis showed that the purified enzyme was a three subunit protein. The molecular weight of the subunit was about 58 kDa.The catalytic experiments in vitro showed that the enzyme had both catalase activity and monophenolase activity (L- tyrosine as substrate) and bisphenol enzyme activity (L-DOPA) as substrate. The optimum pH value and km value are different: catalase activity is 20 鈩，

本文编号：1591845