金黄色葡萄球菌噬菌体GH15穿孔素功能研究
本文选题：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 切入点：烈性噬菌体 出处：《吉林大学》2016年博士论文 论文类型：学位论文
【摘要】：金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)是一种人畜共患病的重要病原菌,可引起全身和局部性的感染性疾病。耐药菌株特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicilin-resistant S.aureus,MRSA)的出现,极大的增加了细菌感染性疾病治疗的难度。噬菌体(bacteriophage)是一种以细菌为宿主,可以感染和裂解细菌的病毒,以其独特的作用机制能够快速杀灭特定病原菌,使其在耐药细菌感染治疗方面具有很大应用潜力。本研究以金黄色葡萄球菌的噬菌体GH15裂解系统作为研究对象,在本课题组揭示的裂解酶结构功能的基础上,系统研究噬菌体GH15穿孔素(Hol GH15)。确定穿孔素Hol GH15基因、重组Hol GH15的表达、生物学活性、作用机制及其应用研究,同时探索噬菌体GH15、裂解酶对MRSA生物被膜的作用。为应用噬菌体裂解系统防控金黄色葡萄球菌感染奠定理论基础。首先通过序列比对和生物信息学分析预测噬菌体GH15的穿孔素基因,确定噬菌体GH15穿孔素基因(Hol GH15)位于噬菌体裂解模块中,并且与裂解酶基因(Lys GH15)相邻。Hol GH15为具有两个跨膜区的膜蛋白,其N-端和C-端都分布于细胞质内,具有II类穿孔素特征。Hol GH15的13~95位氨基酸与噬菌体穿孔素蛋白家族Phage_holin_1家族成员具有很高的同源性,属于Phage_holin_1超家族。同时,Hol GH15与已经公布预测可能为革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌,发酵乳杆菌和链球菌)噬菌体holin进行比对,Hol GH15仅与金黄色葡萄球菌噬菌体K穿孔素同源性最高(95%),其它低于60%。为了进一步研究穿孔素基因(Hol GH15)的功能,对其进行了原核表达。在表达过程中发现,表达的Hol GH15能够抑制宿主菌生长。通过检测Hol GH15对能量毒素敏感性和亚细胞定位特征,确认了Hol GH15基因具有编码穿孔素的功能。构建跨膜区(transmembrane domain,TMD)缺失Hol GH15-TMD1(-)和Hol GH15-TMD2(-),证明TMD是Hol GH15发挥生物学活性所必须的。重组Hol GH15蛋白具有胞外抑菌功能,其最佳作用温度37℃,最适p H值5.2。抑菌实验表明,Hol GH15不但能够抑制金黄色葡萄球菌生长,还能抑制铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的生长,对李斯特菌表现为杀菌活性。发现Hol GH15不具有溶血功能,可通过改变细菌细胞膜通透性发挥抑菌和杀菌活性。由于MRSA形成生物膜在持续性感染中起着重要作用,噬菌体GH15及裂解酶Lys GH15对MRSA表现出广谱、高效的裂解活性。因而,进一步探讨噬菌体GH15及Lys GH15对生物被膜的作用。本研究采用24孔板法培养生物被膜,其中17株(17/28)形成生物被膜的能力较强。分别用噬菌体GH15和Lys GH15处理生物被膜,发现噬菌体GH15和Lys GH15都可以清除形成的生物被膜,噬菌体GH15还能抑制生物被膜的形成。噬菌体GH15在非离子清洁剂、10 mmol EDTA、蒸馏水和10%血清中活性稳定,与1%Triton X-100联合应用清除生物被膜能力更强。Lys GH15可以在10μg/m L 1 h内杀灭几乎所有的MRSA生物被膜菌,并将其清除。由于β-内酰胺类抗生素能够抑制细菌细胞壁的形成,Hol GH15作用于细菌细胞膜,二者具有协同抗菌能力,联合应用抗菌能力增强。Hol GH15还能够在低温(4℃)条件下抑制李斯特菌的生长,具有一定的应用价值。综上所述,噬菌体GH15、裂解酶和穿孔素能够在防治金黄色葡萄球菌及其生物被膜,控制李斯特菌方面具有一定的应用价值,可作为新型抗菌剂治疗相关感染。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
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，本文编号：1599081
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