表观修饰在热介导的植物程序性细胞死亡过程中的功能研究

发布时间：2018-03-13 19:12

本文选题：程序性细胞死亡　切入点：细胞凋亡　出处：《武汉大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：细胞周期和程序性细胞死亡过程涉及发育、衰老、非生物压力适应、病原体侵染等多个方面,它一直是基础研究的热点领域。在动物中,程序性细胞死亡分为细胞凋亡、细胞自噬和细胞坏死。三种不同类型的程序性细胞死亡过程存在明显的细胞学和生理生化差异,并且不同类型过程的分子信号通路之间是相互独立而又密切相关的。在植物中,目前对程序性细胞死亡过程的分类并不十分清晰,因为各个程序性细胞死亡案例的分子调控网络之间差异性很大。因此,不同程序性细胞死亡案例的调控网络研究可以为区分不同类型的程序性细胞死亡过程提供依据。染色质修饰是表观遗传学的一个重要分支,它可以通过对染色质结构的调控来调节基因表达。在很多重要的生物学过程中染色质调控都起着关键性的作用,比如说诱导多能干细胞(iPS)的分化、生殖细胞的形成、种子萌发、植物逆境反应等。尽管如此,在程序性细胞死亡过程中的染色质修饰研究至今还是寥寥无几。对细胞周期和热介导的程序性细胞死亡过程中染色质修饰的功能研究不仅可以揭示各种染色质修饰或者染色质修饰酶的功能多样性,而且还能加深人们对细胞周期和程序性细胞死亡过程分子调控网络的理解。本论文主要以玉米幼苗为材料研究细胞周期和热介导的程序性细胞死亡过程中的分子调控网络、表观修饰调控、rDNA调控,试图揭示不同程序性细胞死亡过程中染色质修饰的功能。本论文包括以下研究内容：1.热压力诱导的玉米幼苗叶片程序性细胞死亡过程中的组蛋白修饰调控我们使用DNA ladder和TUNEL实验检测到热压力诱导玉米幼苗叶片发生程序性细胞死亡。活性氧分子含量和相关酶酶活检测结果显示,热处理导致细胞内活性氧分子和活性氧相关酶酶活升高,特别是热压力诱导的玉米幼苗叶片程序性细胞死亡过程中超氧负离子含量和活性氧相关酶酶活明显升高。活性氧分子积累通常会导致膜系统损伤,细胞膜通透性实验显示,活性氧分子造成细胞膜通透性增加。另外,蛋白免疫印迹和荧光免疫染色结果表明,在热压力诱导的玉米幼苗叶片程序性细胞死亡过程中基因组水平组蛋白H3K9、H4K5、H3乙酰化升高,组蛋白H3K4二甲基化不变,组蛋白H3K9二甲基化降低,同时伴随着染色质脱浓缩。为了研究程序性细胞死亡过程中组蛋白修饰变化和活性氧分子积累之间的关系,我们使用低浓度表观修饰抑制剂处理玉米幼苗,观察玉米幼苗叶片细胞的生理生化和表观修饰变化。我们使用了两个组蛋白磷酸化抑制剂H89和AT13148,两个DNA甲基化抑制剂5-AC和RG108,两个组蛋白去乙酰化抑制剂TSA和CUDC-101。结果显示,这些低浓度表观修饰抑制剂可以导致基因组水平组蛋白H4K5乙酰化升高,并且玉米幼苗叶片细胞阻滞在有丝分裂早前期。进一步的活性氧分子含量和活性氧相关酶酶活检测结果表明,低浓度表观修饰抑制剂诱导的细胞周期阻滞过程中细胞内氧压升高,于是我们以这个细胞周期阻滞现象为模型研究细胞内活性氧水平和表观修饰变化之间的关系。抗氧化剂硫脲可以缓解低浓度表观修饰抑制剂诱导的细胞周期阻滞过程,这说明活性氧分子调控这些细胞周期阻滞过程并且表观修饰变化调节细胞内活性氧水平。由于低浓度表观修饰抑制剂只导致基因组水平组蛋白H4K5乙酰化升高,所以我们使用高浓度组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA来更好地模拟基因组水平组蛋白高乙酰化状态。高浓度TSA可以导致细胞内活性氧水平升高,这说明热压力诱导的玉米幼苗叶片程序性细胞死亡过程中很可能是组蛋白修饰变化调节细胞内活性氧水平。为了研究热压力诱导的玉米叶片程序性细胞死亡过程中凋亡相关基因的表观修饰调控,我们使用定量实时PCR和染色质免疫共沉淀实验检测基因表达和启动子区域组蛋白修饰情况。定量实时PCR实验表明,热压力诱导的程序性细胞死亡过程中抑凋亡基因hexokinase表达量降低,促凋亡基因metacaspase type Ⅱ和putative metacaspase表达量升高；同时组蛋白乙酰转移酶基因GCN5和HAT-B表达量升高,组蛋白去乙酰化酶基因HDAC101表达量降低。进一步的染色质免疫共沉淀实验证实,组蛋白修饰在hexokinase和putative metacaspase基因表达中起调控作用。2.热压力下的45S rDNA表观修饰调控我们使用荧光免疫染色检测到热压力下玉米幼苗叶片细胞核仁裂解的现象,核仁裂解的细胞比例随着热处理时间的延长而增加。为了研究热压力下核仁裂解的功能,我们使用荧光原位杂交实验检测45S rDNA在热压力下的变化。荧光原位杂交的结果显示,在热处理1天时45S rDNA脱浓缩细胞比例高于未处理组,在热处理2天和3天时45S rDNA脱浓缩细胞比例与未处理组没有差异,在热处理6天时45S rDNA脱浓缩细胞比例又明显高于未处理组。热压力下核仁和45S rDNA的变化不一样,这说明它们在热压力下的功能存在差异。为了进一步研究45S rDNA在热压力下的功能,我们使用定量实时PCR实验检测45S rDNA的转录情况。定量实时PCR结果表明,在热处理1天时45S rDNA的ETS和18S区域转录量都明显高于未处理组,这说明热压力激活45S rDNA转录；在热处理2天和3天时45S rDNA的ETS和18S区域转录量都略高于未处理组,这说明热压力没有明显激活45S rDNA转录；在热处理4天后45S rDNA的ETS区域转录量远远高于未处理组,而45S rDNA的18S区域转录量只是略高于未处理组,这说明热压力诱导的玉米幼苗叶片程序性细胞死亡过程中45SrDNA转录起始激活并且转录延伸受到抑制。45S rDNA转录情况在热压力过程中快速变化,这说明45S rDNA在热压力下受到不同形式的调控。为了研究表观修饰在45S rDNA转录调控中的功能,我们使用质谱和染色质免疫共沉淀实验检测45S rDNA转录变化过程中启动子区域DNA甲基化和组蛋白修饰的变化情况。45S rDNA启动子区域DNA甲基化结果显示,热压力下该区域各个位点的DNA甲基化情况没有明显变化。染色质免疫共沉淀实验显示,组蛋白修饰在45S rDNA转录起始过程中起调控作用,而与热压力诱导的玉米幼苗叶片程序性细胞死亡过程中45S rDNA转录延伸抑制没有直接关系。
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【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q942.5

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