地衣芽孢杆菌及其γ-聚谷氨酸合成调控机理的系统生物学研究

发布时间：2018-03-17 19:30

  本文选题：地衣芽孢杆菌　切入点：γ-聚谷氨酸(γ-PGA)　出处：《华中农业大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是革兰氏阳性细菌,广泛地应用于多个领域:在农业方面,它可以作为一种益生菌和微生物肥料;在生物制造产业,它可以用来生产各种酶、抗生素、乙偶姻、2,3-丁二醇和γ-聚谷氨酸(Poly-γ-glutamic acid,γ-PGA)等产品。γ-PGA是一种多聚氨基酸高分子聚合物,对环境以及人体无害,能够作为重金属吸附剂、保湿剂、肥料吸收促进剂、饲料营养助剂等,广泛应用于农业、食品、饲料、化妆品、医药和污水处理等领域。本研究中的地衣芽孢杆菌WX-02菌株主要是从应城盐渍土中分离得到的。它在正常条件下可以合成γ-PGA,在高盐,高温等胁迫环境下可以高产γ-PGA。本论文综合性地分析了地衣芽孢杆菌的基因组、转录组、生物网络,并结合这几方面系统地研究了其代谢产物γ-PGA的合成调控及其在盐胁迫条件下高产的分子机理,取得了以下几方面研究结果:(1)完整地解析了地衣芽孢杆菌WX-02菌株的基因组信息,其基因组由长度为4286821 bp的一条环状染色体组成,含有4512个蛋白编码基因,24个rRNA基因及79个tRNA基因,GC含量为46.1%。(2)基于地衣芽孢杆菌WX-02完整的基因组信息,本研究测得了其在非盐胁迫和盐胁迫条件下三个时间点的链特异性转录组数据:11th h(不加入6%NaCl);22th h(加入6%NaCl后11h,短期盐胁迫);33th h(加入6%NaCl后22h,长期盐胁迫)。基于转录组数据分析识别了90个sRNA,1169个反义转录本(对应734个正义链基因)及871个操纵子结构。另外,通过DEGseq软件分析比较了非盐胁迫和盐胁迫条件下的差异表达基因(FDR≤0.001,|log2FC|≥1),发现相对于11th h而言,分别有234和1439个基因在22th h显著性的上调和下调表达;在33th h,分别有229和1427个基因显著性的上调和下调表达。而22th h和33th h只有133个基因的转录水平发生显著性变化。上述结果表明,在盐胁迫条件下大部分基因的表达水平都被显著性抑制,而短期盐胁迫和长期盐胁迫条件下的基因表达水平变化并不明显。差异表达基因中与能量代谢、氨基酸转运等相关的功能类基因上调和下调的数量基本相当,表明这些基因在盐胁迫条件下大部分被激活,从而能够提供足够的底物和能量来维持细胞生存。盐胁迫条件下,氨基酸合成相关基因,特别是与谷氨酸和脯氨酸代谢相关基因的表达水平都发生显著性变化,如gltABC(共同编码谷氨酸-α-酮戊二酸酰胺转移酶),gltP(谷氨酸转运体)及ycgMNO等都上调表达了,而gudB(编码谷氨酸脱氢酶)则下调表达了,这些基因表达水平的变化都直接或间接地促进了谷氨酸产量的增加,从而使得γ-PGA在盐胁迫环境下能够高产。(3)本研究基于直系同源及结构域映射方法构建了地衣芽孢杆菌WX-02全基因组水平的蛋白质相互作用(PPI)网络。并从蛋白质结构特征,功能相似性及转录水平相关性三方面对网络进行了评估,最终网络含有2448个蛋白及15864个PPIs,且具有高度准确性。结合转录组数据,我们探究了非盐胁迫和盐胁迫条件下PPI网络的动态变化,分别对比分析了三个时间点(11th h,22th h,33th h)对应的PPI网络,发现非盐胁迫和盐胁迫条件下PPI网络没有明显的变化且基本不受外界环境影响。另外,通过网络识别了267个不同的蛋白复合体,并注释出117个未知蛋白的功能。通过分析γ-PGA相关的子网络,发现转录调控因子CcpA与多数γ-PGA合成及调控相关的蛋白具有直接或间接的互作关系,如PgsB,GltA,GltB,Pro B,ProJ,YcgM及双信号转导系统Com P-ComA和DegS-DegU。由此推断CcpA可能在γ-PGA合成及调控中起到一个非常至关重要的作用。(4)为进一步研究地衣芽孢杆菌WX-02的基本代谢情况及γ-PGA合成调控相关的重要代谢物及路径,本研究基于地衣芽孢杆菌WX-02的基因组注释信息及目前已有的代谢信息构建得到了其代谢网络模型i WX1009,该模型含有1009个基因,1141个代谢物及1761个反应。初步得到的代谢网络模型通过PM表型芯片实验进行了校正和评估,i WX1009和表型芯片实验数据具有76.8%的一致性。表明网络模型具有高度可靠性,能够很好地模拟真实的代谢情况。通过iWX1009模型模拟,发现在LB培养基中地衣芽孢杆菌WX-02含有195个重要基因,且其中149个可以被枯草芽胞杆菌(B.subtilis)168实验数据证实。另外通过优化γ-PGA生产相关的代谢路径,发现从网络中移除5个反应(rxn00800,rxn00097,rxn05164,rxn05299及rxn00047)可以使得γ-PGA的产量最大化。另外通过网络模型我们分析推导出了γ-PGA合成的相关代谢物及代谢路径。本研究应用系统生物学方法探究了调控γ-PGA合成的潜在因子、代谢物及代谢路径,初步阐明了γ-PGA的代谢调控机理,为构建γ-PGA高效规模化生产的基因工程菌株奠定了理论基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q93

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本文编号：1626173