59在小鼠肌肉细胞分化过程中的功能研究

发布时间：2016-11-06 12:31

  本文关键词：ClipR-59在小鼠肌肉细胞分化过程中的功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

《中国农业大学》 2015年

ClipR-59在小鼠肌肉细胞分化过程中的功能研究

孙英民  

【摘要】：ClipR-59(Cytoplasmic linker protein related59kD protein)是一种细胞膜蛋白,它有四个结构域,分别为：N端富含谷氨酸和脯氨酸的E/P结构域,Ankryin repeat结构域,CAP-Gly(cytoskeleton-associated protein glycine-rich domain)结构域和与细胞膜作用的Membrane Binding Domain即MBD结构域。在脂肪细胞内,ClipR-59与Akt相互作用并增加其在细胞膜上的分布,提高AS160的磷酸化水平,促进Glut4分子的细胞膜移位；ClipR-59与TNF受体作用,通过调控TNFα信号传导,进行调节细胞凋亡。研究证实,ClipR-59基因敲除小鼠在胚胎发育的后期会由于窒息而死亡。本研究就是以ClipR-59为诱饵,通过酵母双杂交系统,寻找与它相互作用的新蛋白,揭示其新功能,并阐释其机制。 前人研究结果发现,Elmo2通过Elmo2-Dock180-Rac1信号通路调控肌细胞的融合。在筛选得到同ClipR-59相互作用的蛋白中,最终选择了Elmo2蛋白进行后续研究。研究发现ClipR-59同Elmo2相互作用,通过调节Rac1的活性进行调控肌细胞的融合。 首先,免疫共沉淀实验证实,ClipR-59;和Elmo2在体内和体外都是相互作用的,通过免疫荧光实验发现ClipR-59和Elmo2在细胞内有相同的定位分布。其次,以C2C12细胞为体外研究模型,观察ClipR-59在肌肉细胞分化过程中的表达。结果发现,ClipR-59蛋白的表达量逐渐增加,并与分化标记蛋白Myogenin, Myosin Heavy Chain的表达量变化趋势一致。用表达ClipR-59shRNA的慢病毒感染C2C12细胞,诱导分化结果显示,抑制ClipR-59的表达,C2C12细胞的分化也受到抑制；并且抑制ClipR-59的表达不影响分化标记蛋白Myogenin的表达。这说明ClipR-59影响的是肌肉细胞分化后期所发生的融合过程,而不是早期分化基因的表达。再次,分别对Elmo2和ClipR-59蛋白做一系列去掉不同结构域的突变,通过GST (Glutathione S-transferase)-Pull down实验证实Elmo2通过PH结构域同ClipR-59相互作用,ClipR-59通过N端的E/P结构域同Elmo2相互作用。通过Co-IP实验证实ClipR-59, Elmo2和Dock180形成一个异源复合体。通过GST-CRIB(Cdc24/Rac1interactive binding domain of p21activated kinase) pull down实验证明：过表达Elmo2和ClipR-59将增加Racl活性；在C2C12细胞内,干涉ClipR-59的表达将抑制Racl的活性。接下来,分别用表达ClipR-59和ΔE/PClipR-59的逆转录病毒感染C2C12细胞,分化结果显示,过表达ClipR-59可以增加C2C12细胞的融合,与对照相比,融合系数增加约10%;而过表达与Elmo2没有作用的ΔE/P ClipR-59则抑制C2C12细胞的融合。在表达ClipR-59shRNA的C2C12细胞内,过表达ClipR-59可以逆转C2C12细胞的融合,而ΔE/P ClipR-59却达不到这种效果,说明ClipR-59依赖于同Elmo2相互作用调控肌细胞的融合。最后,通过GST-Pull down实验证实了Insulin调控Elmo2同ClipR-59之间的相互作用；用带P-Tyr抗体的Beads IP Elmo2, Western Blot结果显示,Elmo2是一种酪氨酸被磷酸化修饰的蛋白；通过点突变分析得知,主要的磷酸化位点为第713位的酪氨酸。 综上,我们研究发现ClipR-59同Elmo2目互作用,通过调节Racl的活性进行调控肌细胞的融合。这项研究发现为进一步研究ClipR-59在肌肉发育过程中的作用提供理论依据。

【关键词】：
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q343
【目录】：

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