LBD家族蛋白的二聚化和DNA识别的结构基础

发布时间：2018-03-29 03:32

  本文选题：蛋白晶体三维结构　切入点：LBD家族蛋白　出处：《西北农林科技大学》2017年博士论文

【摘要】：LBD家族蛋白通过精确调控其下游基因的时空特异性表达来控制植物的发育模式。它们参与高等植物的许多生长发育和代谢过程,如分生组织分化、叶片发育、花序形态建成、花粉发育和侧根发育等。最近的研究显示,LBD家族蛋白还与植物再生、光形态建成及疾病易感性等密切相关。LBD蛋白是高等植物特有的,它们在高等植物中广泛分布,目前,模式植物拟南芥中已发现43种LBD蛋白,重要粮食作物水稻和玉米则分别有35种和44种LBD蛋白被发现。LOB结构域是位于LBD蛋白N端的高度保守的功能结构域,已有研究表明,其和LBD蛋白的二聚化及DNA结合特性密切相关。本研究中,我们解析了LBD家族蛋白圆锥小麦Ramosa2的N端LOB结构域(TtRa2 LD)的晶体三维结构,这是已报道的第一个LOB结构域的三维结构,其分辨率可达1.88?。TtRa2 LD具有独特的空间折叠结构特征。由晶体结构可知,TtRa2 LD以二聚体的形式存在,每个对称单元包含两个中心对称的单体蛋白。每个单体蛋白折叠成5个α螺旋,有5种明显的构件组成:1个紧凑的Zinc finger模体、1个由两个互相垂直的α螺旋(α2和α3)组成的GAS模体、1个含长α螺旋(α5)的coiled coil结构以及连接G AS模体和coiled coil结构的α4和DPVYG模体。TtRa2 LD的锌指模体是一类新的Cys4型锌指结构,其由1个α螺旋(α1)和其两端的无规则卷曲片段组成。其和已知的Cys4型锌指蛋白没有序列和结构同源性,而是与GAL4的部分Zn2/Cys6锌指模体在结构上比较相近。锌指模体中4个保守的半胱氨酸残基:Cys28、Cys31、Cys38和Cys42和位于四面体中心的Zn离子形成配位键从而维持其特定的稳定构象。DNA结合实验和圆二色谱实验结果显示,随着EDTA浓度的升高,TtRa2 LD的二级结构也会发生改变,其DNA结合活性也会随之下降。这说明,Zn2+对锌指模体维持其有效结合DNA的正确构象是至关重要的。TtRa2 LD的Coiled coil结构中的疏水作用是TtRa2 LD二聚化的主要作用力,此区域的盐桥连接及其C末端的π-πstacking并不是维持其二聚化所必须的。双分子荧光互补试验和DNA结合实验结果显示,Tt Ra2 LD在植物细胞内能形成同源二聚体,Coiled coil结构介导的二聚化与TtRa2 LD的DNA结合活性密切相关。TtRa2 LD的GAS模体由2个互相垂直的α螺旋α2和α3组成,它们通过1个位于中心的高度保守的Gly64来连接。TtRa2 LD的α4和α5之间通过1个保守的DPVYG模体连接,DPVYG模体中氨基酸残基之间的氢键相互作用能使α4和α5之间形成稳定的近直角构象,这有助于TtRa2 LD二聚体的形成。GAS模体、α4和DPVYG模体共同参与稳定TtRa2 LD二聚体的空间结构。TtRa2 LD二聚体中1个α4的Arg94、Glu90能分别和另1个α4’的Glu90’、Arg94’形成两对盐桥连接;其1个GAS模体的Val62和Asn67还能分别和另1个对称的GAS模体的Asn 67’和Val62’之间形成氢键连接,从而稳定TtRa2 LD二聚体。点突变实验证明了TtRa2 LD二聚体中两个α4之间形成的盐桥连接和二聚体的稳定及DNA结合活性紧密相关,其可能起到精确控制TtRa2 LD二聚体中两个锌指模体之间的相对位置的作用,而TtRa2 LD二聚体中2个单体蛋白的GAS模体之间的互作则存在着一定的灵活性。本研究基于LOB结构域的三维空间结构,利用分子动力学模拟及位点突变实验建立并验证了LOB结构域-DNA互作的Docking模型。根据模型可知,TtRa2 LD利用其Zinc finger模体中位于α1下游的柔性环插入到靶DNA的大沟中,从而对LBD motif进行识别和结合。点突变实验结果证明,TtRa2 LD主要依靠柔性环中的Arg35、Arg36对LBD motif进行识别和结合,Lys37也在一定程度上参与其对LBD motif的结合。TtRa2 LD对于含两个回文LBD motif但间距不同的DNA底物的结合能力也有明显差异。其对间隔序列长度为4bp、6bp的DNA底物的结合能力较强,而当间隔序列长度缩短为1bp或增加到8bp、12bp后,TtRa2 LD对其结合能力也会明显降低。这说明,Tt Ra2 LD对其靶DNA的识别和结合受2个回文LBD motif之间不同间距的限制,但也存在一定程度的灵活性。
[Abstract]:The specific expression pattern of LBD protein family through the precise regulation of the downstream gene to control plant growth and development. Many of their metabolic processes in higher plants, such as meristem differentiation, leaf development, inflorescence morphogenesis, pollen development and lateral root development. Recent studies show that LBD family proteins and plant regeneration. Photomorphogenesis and disease susceptibility is closely related to higher.LBD protein is unique to plants, they are widely distributed in higher plants, at present, 43 LBD proteins have been found in plants, an important crop of rice and maize were 35 and 44 LBD protein was found in.LOB domain in LBD protein N the end of the highly conserved functional domains, studies have shown that dimerization and DNA binding protein LBD and its characteristics are closely related. In this study, we analyzed LBD protein family circle 閿ュ皬楹�Ramosa2鐨凬绔疞OB缁撴瀯鍩，

本文编号：1679383