画眉基因组BAC文库构建及防御素基因解析

发布时间：2018-03-30 22:05

本文选题：Reverse-4D文库　切入点：AvBDs　出处：《浙江大学》2015年博士论文

【摘要】：画眉(Hwamei, Garrulax canorus)为鸟类最大的目——雀形目,的一种鸣禽,因其声音婉转悠扬成为中华社区最普遍的笼养鸟类之一。先天性免疫是第一线的免疫防御系统,在体液免疫应答前发挥着重要的作用。鸟类p防御素基因(avian beta-defensins, AvBDs)是鸟类先天性免疫系统不可分割的重要组成部分。鸟类是动物性致病菌的重要宿主之一,因此对于鸟类防御素系统的研究有助于理解鸟类的免疫防御机制。细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosomes, BACs)文库广泛应用于物理作图和基因组测序等方面。BAC文库的构建是一项费时费力的工作,相关参数和步骤的改进都会显著提高构建的文库质量,改进后续的基因测序、组装过程，从而降低建库和测序成本。本文中,作者构建了6.23倍基因组覆盖度的画眉Reverse-4D文库,文库由14个超级库,55个亚库所构成,包含约60500个克隆。通过对随机挑选的110个克隆进行分析，发现此文库的平均插入片段大小约为133.8kb。因此对该文库进行筛选,得到任一基因的概率约为99.80%。文库的构建过程中,作者从细胞包埋浓度、电脉参数、连接条件和电转化参数四个方面对文库的构建过程进行了优化。首先,作者对包埋细胞浓度进行了优化,发现最佳包埋浓度约为2.5×108cells/mL;其次,为了减少脉冲场电泳中小分子片段的共迁移作用,作者以三次电泳替代了两次电泳,其中前两次电泳在同一块脉冲场胶中完成,有效地去除了小分子和减少了物理剪切作用,产生了较大的片段用于后续的连接过程；第三,作者将DNA和vector勺比率限制为DNA/vector=1/5-1/10,降低了DNA的用量,有利于减少嵌合体克隆的产生；第四,经过试验,确定了最佳的电转化参数为200ohms,25μF,1.5kV,其延长的电转化时间有利于导入更大的片段。画眉的防御素基因簇由两个BAC克隆拼接而成,BAC44 (SP6B4D3)和BAC55 (SP1-9B6E10),大小分别为165kb和160kb。防御素基因区域的大小约为177kb,包含30个防御素基因,远大于珍珠鸟相对应区域大小(127kb)。研究发现画眉防御素有以下几个主要特征：第一,AvBD1和AvBD3分别复制产生了4个和16个子代基因,不同于已测序鸟类中的串联分布,AvBD1和AvBD3形成镶嵌排布的格局；第二,画眉中没有发现AvBD167β和AvBD14,这个结果与珍珠鸟的研究结果一致,证明这两个基因在雀形目中缺失；第三,除以上基因外的基因为直系同源基因,它们在基因位置、方向上保持了高度的线性关系；第四,重复序列在画眉防御素区域内占有较大比重(22.56%),高于原鸡(17.11%),且其成分与原鸡有较大差异。原鸡中的主要成分为反转录元件的LINEs(占重复序列的86.81%,主要是CR1),而画眉中LINEs仅占39.32%,其它的重复序列主要为LTRs元件(51.85%)；第五,重复序列元件作为进化的代理,直接或间接地引起防御素基因拷贝数的变化,复制过程遵循DDSA模型。广泛分布的重复序列为非同源重组提供了重组位点,而且重复序列改变了染色体构象,可能造成基因组的不稳定性,以利于发生复制事件。荧光原位杂交技术(FISH)实验表明,画眉防御素的两个BAC定位于第三号染色体长臂的末端,染色体末端有利于发生重组,因此可能赋予防御表基因更高的变异性和多态性。画眉防御素的定位和基因组测序鸟类的防御素定位相同,说明了防御素基因位置的保守性。防御素的荧光信号仅定位于一对同源染色体上,这不同于哺乳类(人类和小鼠)中的情况,哺乳类的防御素基因簇散布于四对或五对同源染色体上。组织特异性表达分析实验表明,大部分直系同源基因(AvBD2、AvBD4、 AvBD5、AvBD9、AvBD10、AvBD11和AvBD13)在调查的13个组织样品中呈现广泛的表达。少量直系同源基因(AvBD8和AvBD12)和所有的旁系基因呈现出组织特异性的表达。有趣的是,发生复制的旁系基因主要表达于上下呼吸道、舌和脾,少量表达于其它器官。鉴于呼吸道、舌和脾在气体交换、体温调节、声音和免疫等方面的重要作用,这可能暗示了在进化过程中,旁系基因受到正选择作用,从而产生了一系列的复制过程。此外,AvBD1和AvBD3派生基因的组织特异性表达可能有利于降低呼吸系统的疾病易感性。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78

【参考文献】