比较蛋白质组学解析绿针假单胞菌G5菌株GacA功能

发布时间：2018-04-01 00:15

本文选题：植物内生菌　切入点：绿针假单胞菌G5　出处：《江苏大学》2016年博士论文

【摘要】：GacS/GacA双组分信号转导系统普遍存在于革兰氏阴性细菌中,它主要通过控制RsmB家族sRNAs的转录拮抗翻译抑制蛋白RsmA全局调控多种细菌生理活动和行为,包括运动性与生物膜形成、胞外酶、抗生素和植物生长素IAA的产生等,与细菌的生防活性或致病性,以及细菌耐药性、植物生长促进等密切相关。因此,在食品、农业、环境、医疗和生物制药相关细菌的研究中受到广泛关注。GacS/GacA系统由感应激酶GacS和反应调控子GacA组成,GacA在不同细菌中高度保守,但Gac系统调控的功能在不同细菌属种或菌株中,以及不同生长环境中表现出明显的差异。绿针假单胞菌G5是分离自香菜的内生菌,前期研究表明G5能产生蛋白酶,几丁质酶和嗜铁素；以及氢氰酸(HCN),吩嗪和IAA等次生代谢物质,具有生防活性和植物生长促进作用。然而在菌株G5中GacA的调控作用目前尚不清楚。本研究以绿针假单胞菌G5为目标菌株,利用差异蛋白质组学方法首次全局解析了稳定生长期gacA突变对全细胞蛋白表达谱,以及外分泌蛋白表达谱的影响；并借助于生物信息学等方法对鉴定蛋白的功能进行了深入分析；进一步通过表型分析对GacA调控的关键差异蛋白点进行了验证。以期更好地了解gacA在菌株G5中的生物学功能。GacA作为全局性调控子,研究其分子功能不仅可以进一步了解其复杂的级联调控机制,也有利于从分子水平上改良G5的生防性状。旨在为研发环境友好的多功能生物农药／肥料,保护生态、实现农业可持续发展,保障食品安全和人类健康奠定基础。主要研究结果如下：1)野生菌G5和gacA突变体G5-6培养24h至稳定期后,运用比较蛋白质组学分析了gacA失活对全细胞蛋白和外分泌蛋白表达丰度的影响,质谱鉴定出244个丰度变化2倍以上的蛋白点,代表着210种蛋白。和野生菌G5相比,gacA突变体全细胞蛋白中有38个点丰度上升,89个下降；细胞外分泌蛋白中91个蛋白点丰度上升,26个蛋白点丰度下降。2)GO功能分析显示这些差异蛋白点参与多种生物学过程,包括氨基酸、糖类、脂、脂肪、核酸及无机物质的代谢,蛋白质的折叠与降解,底物转运,分泌,信号转导,防御反应和氧化还原胁迫等。在鉴定的蛋白中,39个蛋白点与胁迫反应相关,33个蛋白点与底物转运有关,29个蛋白点与氨基酸合成代谢相关,26个蛋白点则参与了碳水化合物的代谢与能量转换。KEGG分析显示多个蛋白参与了TCA循环,糖酵解,糖异生等代谢通路。主要差异蛋白点描述如下：3)GacA正调控G5菌株生防因子的产生。蛋白质组学分析表明与吩嗪抗生素生物合成相关的蛋白PhzB、PhzF、PhzD和PhzO在突变体中均不表达。碱性蛋白酶AprA,几丁质酶ChiC_1、ChiC_2以及丝氨酸蛋白酶PspA、PspB的表达水平也显著下降。表型分析表明gacA失活致使G5失去蛋白质水解能力。4) GacA正调控T6SS分泌系统的表达。gacA突变显著降低了VI型分泌系统中TssC2、效应因子Hcp、Vgr家族蛋白的表达,暗示着GacA突变可能影响细菌与细菌之间,以及与植物寄主之间的相互作用。5)GacA与细菌生态适应性密切相关。严谨饥饿蛋白SspA及超氧化物歧化酶SodB在突变体中的表达量均升高10倍以上。表型分析证实了GacA负调控超氧化物歧化酶SOD及过氧化氢酶活性,可能影响细菌的胁迫耐受性。6)四个与鞭毛合成与装配相关的蛋白FliC、FlgK、FlgL和Flil在gacA突变体中的表达水平均升高。鞭毛提取组合SDS-PAGE和质谱鉴定证实了GacA负调控鞭毛蛋白的合成。突变体中鞭毛蛋白丰度增加,而细菌运动性下降表明细菌运动性受多种因素影响,并非完全依赖于鞭毛蛋白。7) GacA突变改变了细胞外膜结构,导致了细胞壁肽聚糖合成蛋白Ddl和LPS脂多糖合成相关的LxpC蛋白表达水平升高。进一步Tricine SDS-PAGE分析证明了gacA突变体中脂多糖LPS合成增加。8) gacA突变降低了植物生长素IAA合成相关的邻氨基苯甲酸合成酶TrpE蛋白的表达水平。HPLC检测证实gacA突变后IAA的产量减少,说明GacA正调控IAA产生。相反在根际促生菌P. chlororaphis 06中GacS负调控IAA生物合成,表明Gac系统对IAA的调控具有菌株特异性,与其生态位相关。综上所述,GacA在G5菌株中全局调控细菌的多种生物学进程和生理行为,在细菌生防、营养与竞争、生态适应性、以及细菌与寄主植物间的互作等诸多方面发挥着重要作用。
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【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q93

【参考文献】