水稻叶绿体缺陷突变体wsl3的基因克隆与功能研究

发布时间：2018-04-01 23:30

  本文选题：水稻　切入点：图位克隆　出处：《南京农业大学》2016年博士论文

【摘要】：叶绿体中的多蛋白复合体大多由叶绿体基因编码的核心亚基与核基因编码的外围亚基组成,叶绿体的分化、发育、功能和维持均依赖于叶绿体基因与核基因的紧密协同表达。叶绿体的分化和发育需要叶绿体基因的正确表达,叶绿体基因由叶绿体RNA聚合酶负责转录。叶绿体中至少存在两种类型的RNA聚合酶:核基因编码的单亚基RNA聚合酶NEP和叶绿体基因编码的多亚基RNA聚合酶PEP。NEP主要在叶绿体发育的早期转录持家基因。PEP是成熟叶绿体中最重要的RNA聚合酶。PEP复合体的任何改变都可能导致其转录活性受损,使叶绿体发育异常。pap突变体的白化或黄化表型表明PAPs对于PEP的功能十分重要。所有的PAPs都属于TACs,但并非所有的拟南芥tac单突变体都表现白化或黄化表型。WHY蛋白和pTAC12蛋白在拟南芥和玉米中的分布说明PEP复合体的组成在双子叶植物和单子叶植物中存在一定差异。目前关于PEP复合体外围亚基的研究主要在拟南芥中进行,在玉米中也有少量相关基因被克隆,但水稻中尚无此类突变体的报道。尽管很多pap和/或tac突变体的研究显示这些核基因编码的外围亚基与PEP复合体相关联且对PEP的功能很重要,但各个外围亚基之间的关系并不是很清楚。本研究中,我们以一个新的水稻叶绿体缺陷突变体wsl3为材料,利用图位克隆分离到了目的基因WSL3。WSL3基因中9个核苷酸的缺失导致了突变体的苗期表型,与之相伴的是叶绿素含量降低和叶绿体基因表达异常。WSL3能够自身互作,也能与PEP复合体的其他亚基互作。虽然WSL3包含一个可与DNA结合的SAP结构域,但并不能直接结合叶绿体DNA。综上所述,本研究认为WSL3通过与PEP外围亚基的互作来影响PEP的转录活性。本研究也发现WSL3能够与RbcL互作,说明WSL3可能参与了 RuBisCo的代谢活动。本研究首次明确了 WSL3与PEP其他外围亚基间的关系,为进一步了解水稻叶绿体发育的机制和PEP复合体的组成及外围亚基的功能奠定了基础。主要研究结果如下:(1)水稻叶绿体缺陷突变体wsl3是一个对温度敏感的叶色突变体。观察突变体wsl3的叶绿体超微结构和叶绿素含量发现出现白化表型的部位仅有少量未发育的叶绿体或无叶绿体存在。(2)突变体wsl3的白化或白条纹表型受一个隐性核基因控制。本研究利用图位克隆的方法将目的基因定位到了 10号染色体长臂的66-kb区间,测序发现该区域内LOC_Osl0g32540的第9个外显子中缺失了 9个核苷酸。LOC_Os10g32540编码一个包含SAP结构域和一个截短的PLN03218结构域的蛋白。转基因互补试验证实了LOC_OslOg32540就是我们的目的基因,将其命名为WHITE STRIPE LEAF 3 (WSL3)。(3) WSL3蛋白广泛存在于陆生植物中,WSL3是拟南芥AtpTAC3的同源蛋白,缺失的3个氨基酸在陆生植物中高度保守。亚细胞定位和Western-blot证实WSL3定位于叶绿体拟核。WSL3主要在叶绿体发育的第二个阶段表达。WSL3的表达受光诱导。叶绿体编码基因的表达分析说明突变体wsl3的PEP活性下降。以上结果揭示WSL3可能对PEP的转录活性具有重要作用。(4) WSL3与水稻PEP复合体的外围亚基PAP2、PAP3、PAP4、PAP5、PAP7和PAP10互作。使用截断的WSL3片段与以上OsPAPs的Y2H试验发现WSL3中截短的PLN03218结构域负责WSL3与OsPAPs的互作。WSL3有一个SAP结构域,可能参与了 PEP复合体识别并与PEP依赖基因的启动子结合的过程,但cpChIP和Y1H试验显示WSL3参与了 PEP转录的整个过程,且不能直接与叶绿体DNA结合。以上结果说明WSL3是通过与其他外围亚基的互作来影响PEP的转录活性,进而影响叶绿体的正常发育。本研究也发现WSL3能够与RuBisCo的大亚基RbcL互作,提示了PEP复合体功能的多样性。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2

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本文编号：1697804