染色质改构蛋白BRG1在DNA双链断裂修复中的作用及机制研究

  本文关键词：染色质改构蛋白BRG1在DNA双链断裂修复中的作用及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

《东北师范大学》 2015年

染色质改构蛋白BRG1在DNA双链断裂修复中的作用及机制研究

齐文靖  

【摘要】：基因组是生物遗传信息的载体。基因组的稳定性对于生物个体以及种族的生存与延续都具有至关重要的作用。然而生物体内的基因组DNA并不是处于一个绝对安全的环境下,细胞内的自身代谢产物以及细胞外的各种毒性因子的刺激都会造成DNA损伤。损伤的DNA如果不能被及时修复或错误修复就会导致基因突变或缺失,进而危害生物体。为了维持遗传信息的稳定性,真核生物的DNA通过与组蛋白结合进化出复杂紧密的染色质结构。这种致密的结构虽然可以保护整个基因组尽可能免受内外界刺激因子的影响,但同时,这种结构对于DNA的转录,复制和修复等代谢活动却是一个巨大的障碍。因此,染色质结构的动态变化在DNA代谢中扮演着重要的角色。DNA双链断裂(DSBs)是一种严重的致死的DNA损伤类型。生物体为了应对体内的DNA损伤进化出复杂有序的修复机制,以此来维持机体正常的生命代谢活动。在DNA损伤修复过程中涉及许多蛋白的共同参与,其中包括细胞周期调控蛋白、骨架调节蛋白、DNA损伤修复蛋白、染色质结构调控蛋白等。BRG1是染色质改构复合物SWI/SNF的核心催化亚基,具有ATP水解酶的活性。已有研究发现,BRG1与肿瘤发生和基因组不稳定性具有紧密联系。然而,BRG1在DNA双链断裂修复中的作用机制仍不是很明了。本文利用化疗药物依托泊苷(etoposide),博来霉素和紫外激光照射等手段,在体外构建了DNA双链断裂损伤修复模型。通过SW13和U2OS细胞存活率实验,我们发现BRG1缺失会明显增加细胞对DNA损伤药物的敏感性,同时降低受损细胞的生存能力。另外,细胞彗星电泳与免疫荧光实验共同证明了,BRG1对于DNA双链断裂的修复进程具有至关重要的作用。接下来,我们通过染色质分离提取与染色质免疫共沉淀技术发现,BRG1能够被募集到DNA损伤位点。真核生物中DNA双链断裂主要有两种修复途径:同源重组修复和非同源重组末端连接修复。利用DR-GFP与EJ5-GFP报告系统,我们进一步探讨了BRG1参与DNA双链断裂修复的机制。通过流式细胞仪检测DR-GFP与EJ5-GFP报告系统的GFP阳性细胞的比例,我们发现BRG1主要参与同源重组修复途径而不是非同源重组末端连接修复。最后,利用免疫荧光,免疫共沉淀以及活细胞示踪观察实验,我们发现BRG1能够与介导RAD51和RPA替换的RAD52蛋白相互作用,并且调控RAD52在损伤位点的募集,从而调节RPA与RAD51在单链DNA(ssDNA)上的置换过程,进而影响同源链侵入过程的起始。本文研究揭示了染色质改构因子BRG1参与DNA双链断裂修复的作用机制,为阐明染色质结构与DNA代谢的关系提供了一定的证据。

【关键词】：
【学位授予单位】：东北师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q75
【目录】：

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