低pH和铝胁迫下拟南芥蛋白质组比较分析及铝胁迫下AtATRF1基因的功能研究

发布时间：2018-04-06 04:30

  本文选题：低pH胁迫　切入点：Al胁迫　出处：《吉林大学》2017年博士论文

【摘要】：土壤酸化被认为是植物生长的重要限制因子。全世界40%以上的土壤属于酸性土壤。低p H和铝(Al)毒害被认为是酸性土壤中两个主要的障碍因子,二者对植物的毒害特征均是抑制根的伸长。但是,植物响应低p H和Al胁迫的过程中,是否存在相同或不同的生理生化、分子生物学机制,目前尚不清楚。本研究采用Tandem Mass Tag(TMT)技术对低p H和Al分别处理的蛋白质组进行定量比较,筛选、鉴定低p H及Al响应蛋白,并对两者之间的胁迫响应蛋白进行分析;本实验又同时通过克隆和转化的方法,将拟南芥基因组中部分转录因子和泛素化连接酶基因在拟南芥中过表达,检测编码蛋白在转基因拟南芥中的表达是否受Al诱导;最后,对At2G39100(L4975)基因进行了功能验证。主要研究结果如下。1.低p H和Al胁迫下拟南芥根蛋白质组比较分析利用TMT蛋白质组学方法比较低p H和Al胁迫的拟南芥根蛋白质组。处理24 h后,鉴定到345个低p H胁迫响应蛋白,其中231个上调,114个下调,鉴定到509个Al胁迫响应蛋白,其中382个上调,127个下调。同时响应低p H和Al胁迫的蛋白有196个。单独响应低p H胁迫的蛋白有149个,单独响应Al胁迫的蛋白有313个。胁迫响应蛋白转录水平与蛋白水平表达趋势分析表明,根中胁迫响应蛋白受转录后、翻译及翻译后机制的调控。生物信息学分析表明,低p H胁迫响应蛋白富集于58个KEGG代谢通路,Al胁迫响应蛋白富集于66个KEGG代谢通路。对低p H和Al胁迫响应蛋白的GO注释及KEGG信号通路比较分析发现,低p H和Al胁迫均可激活细胞内的能量代谢、蛋白代谢、信号传导途径、抗氧化系统及DNA修复系统等途径。Al胁迫后,细胞壁和细胞骨架相关蛋白的表达受到严重抑制,而低p H胁迫后细胞壁和细胞骨架蛋白量变化相对较小。蛋白质激酶和磷酸酶是Al胁迫途径中的主要信号分子,而低p H胁迫后几乎没有激酶和磷酸酶的响应,说明蛋白激酶/磷酸酶可能不是拟南芥响应低p H胁迫的主要信号分子。综上,我们对低p H和Al胁迫之间的分子水平调控网络有了初步认识,且发现了其调控的相关性以及独立性。2.部分转录因子和E3泛素连接酶基因的克隆转化及验证通过In-fusion技术,从拟南芥Columbia 4(Col 4)中克隆到60个转录因子和40个泛素连接酶基因,并将其构建到植物表达载体p EGAD-LUC,转化到农杆菌AGL0,利用农杆菌介导的蘸花浸染方法转化拟南芥Col 4,并通过Basta抗性筛选、LUC标签检测和基因组鉴定得到T3代转基因阳性苗152株。3.转基因拟南芥中Al响应蛋白的筛选及表型分析25μM Al处理327个转录因子蛋白和420个泛素连接酶蛋白对应的转基因材料,通过Luminometer仪检测12 h内蛋白的表达量。其中,14个转录因子蛋白的相对表达倍数≥1.5,且P值≤0.01,其中,6个相对表达量升高,8个相对表达量降低。泛素连接酶蛋白中,共有18个蛋白的相对表达倍数≥1.5并且P值≤0.01,14个相对表达量升高,4个相对表达量降低。利用western blot方法验证的Al响应蛋白变化趋势与Luminometer仪检测到的蛋白变化趋势一致。Al胁迫下,筛选得到3个表型发生明显变化的转基因拟南芥。泛素连接酶At2G39100(L4975)和b HLH家族转录因子AT1G06170(L2853)对应转基因拟南芥的相对根伸长明显比野生型长,而At5G05910(L0945)RING型泛素连接酶对应转基因拟南芥相对根伸长比野生型短。分析表明,L4975蛋白可能通过参与修复因Al毒害而损伤的DNA、L2853蛋白则可能是通过降低胼胝质在根尖的积累,来提高转基因拟南芥对Al的抗性。4.E3泛素连接酶At ATRF1基因的功能分析At ATRF1(L4975)是拟南芥中的一个RING finger型E3泛素连接酶,包含6个外显子和5个内含子,CDS全长891 bp,编码一个含有296个氨基酸的蛋白,RING finger结构域位于蛋白的N端。At ATRF1蛋白定位在细胞核中,且At ATRF1在转录水平和转录后水平的表达均受Al诱导。At ATRF1在拟南芥中过表达后提高了拟南芥的耐Al性。已知耐Al基因ALMT1、MATE、STOP1、STOP2、STAR1、ALS1、ALS3和ALT2在At ATRF1转基因拟南芥中的表达没有受到影响,而ATR在At ATRF1转基因拟南芥中的表达比野生型拟南芥中的低。据此推测,At ATRF1转基因拟南芥可能通过At ATRF1直接或间接地与At ATR相互作用来提高其耐Al性。综上所述,通过本研究,使我们对低p H和Al胁迫之间的分子水平调控网络有了初步认识,且发现了其调控的相关性以及独立性。筛选得到多个Al胁迫响应蛋白。RING型泛素连接酶基因At2G39100、At5G05910及b HLH家族转录因子基因AT1G06170的转基因拟南芥表型发生明显变化。其中,RING型泛素连接酶At ATRF1(At2G39100)可通过直接或间接地与At ATR相互作用提高拟南芥的耐Al性。
[Abstract]:The effects of low p H and Al stress on protein expression in Arabidopsis thaliana were studied . 浠庢嫙鍗楄姤Columbia 4(Col 4)涓�鍏嬮殕鍒�60涓�杞�褰曞洜瀛愬拰40涓�娉涚礌杩炴帴閰跺熀鍥�,骞跺皢鍏舵瀯寤哄埌妞嶇墿琛ㄨ揪杞戒綋p EGAD-LUC,杞�鍖栧埌鍐滄潌鑿孉GL0,鍒╃敤鍐滄潌鑿屼粙瀵肩殑铇歌姳娴告煋鏂规硶杞�鍖栨嫙鍗楄姤Col 4,骞堕，

本文编号：1717992