猪骨髓间充质干细胞培养体系优化、iPS诱导及miRNA介导的定向分化研究

发布时间：2018-04-09 05:08

本文选题：骨髓间充质干细胞　切入点：培养体系优化　出处：《吉林大学》2016年博士论文

【摘要】：p BMSC是一种应用广泛的成体干细胞,具有自我更新以及多向分化的能力,在干细胞治疗以及临床应用前有效性、安全性评估中具有重要意义。在体外长期培养过程中,p BMSC会逐渐出现增殖缓慢、衰老和分化等问题,此外非定向的干细胞治疗引起的治疗效果不稳定等因素也是制约其在干细胞临床应用的主要原因。为实现p BMSC体外长期培养并维持其细胞增殖和分化潜能,并通过定向分化成特定细胞类型从而实现干细胞定向治疗,本研究通过培养体系优化、i PS诱导以及定向分化等多个方面对p BMSC进行深入研究,为其在基础研究、干细胞治疗以及临床应用前安全性评估等方面提供实验依据。本实验主要研究结果如下:1、通过在p BMSC培养基中添加小分子化合物RG108和A83-01对培养体系进行优化研究,结果显示:(1)在培养基中持续添加1μmol/L A83-01,能够显著增加多能性基因Oct4和Nanog表达水平、增加端粒酶活性并且能够促进细胞增殖;增加细胞抗凋亡基因表达量、减少凋亡基因表达,并且能够保护细胞抵抗凋亡刺激;提高p BMSC成脂分化效率,但对成骨分化并无显著影响。(2)10μmol/L的RG108处理p BMSC 48h能够显著增加多能性基因Oct4和Nanog表达水平、增加端粒酶活性并且能够促进细胞增殖;增加细胞抗凋亡基因表达量、减少凋亡基因表达,并且能够保护细胞抵抗凋亡刺激;显著降低p BMSC中多能性基因启动子区域脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid,DNA)甲基化水平;提高p BMSC成骨分化及成脂分化效率。2、通过比较诱导效率、重编程过程中多能性基因表达谱以及DNA甲基化动态变化等,研究了p BMSC向i PS诱导的调控机制。结果显示:(1)在p BMSC培养基中添加1μmol/L A83-01,能够增加碱性磷酸酶阳性克隆数目,经统计学分析,将i PS诱导效率从0.052%提高至0.0624%,但在诱导过程中对多能性基因表达谱并无显著影响;(2)用10μmol/L RG108处理p BMSC 48h能够显著提高重编程效率至0.924%,将诱导天数从10d缩短至6d,并且在诱导过程中能够极显著提高多能性基因Oct4和Nanog表达量。RG108处理能够降低p BMSC在诱导过程中多能性基因启动子区域DNA甲基化水平,在D8时Oct4和Nanog基因启动子区域DNA甲基化水平显著低于同期对照组。3、通过高表达脂肪细胞分化相关的mi R-17/21/143和胰岛细胞特异的mi R-375,探究其在成脂分化以及成IPC分化中的调控作用。结果显示:(1)高表达mi R-17/21/143皆能够促进成脂分化,其中mi R-21对成脂分化促进作用最为显著;干扰mi R-17对成脂分化无明显影响,但干扰mi R-21/143能够显著抑制p BMSC成脂分化标记基因表达和成熟脂滴形成;将三种mi RNA进行组合诱导发现,同时高表达三种mi RNA能够极显著的提高脂肪细胞诱导效率;(2)mi R-375高表达慢病毒载体能够有效将p BMSC诱导成双硫腙染色呈阳性的细胞克隆;在诱导过程中Oct4基因表达量显著下降,内胚层基因SOX17在D5先升高随后又再次下降,IPC标记基因表达量显著升高;对所获得的IPC进行经葡萄糖刺激检测显示,该细胞具有分泌胰岛素及C肽能力。本研究通过对p BMSC体外长期培养体系进行优化并对其进行i PS诱导效率比较分析,随后利用mi RNA对p BMSC进行成脂及成IPC分化诱导,旨在为p BMSC作为细胞重编程、i PS诱导和定向分化等方面研究中的优越性提供理论基础和实验依据,p BMSC的研究为其在基础研究、干细胞治疗以及临床应用前安全性评估等奠定基础。
[Abstract]:The results showed that : ( 1 ) By adding small molecule compounds RG108 and A83 - 01 into the culture medium , the research results showed that : ( 1 ) By adding small molecule compounds RG108 and A83 - 01 into the culture medium , the research results showed that : ( 1 ) By adding small molecule compounds RG108 and A83 - 01 into the culture medium , the research results showed that : The results showed that : ( 1 ) The high expression of mi R - 17 / 21 / 143 could significantly increase the DNA methylation level of the promoter region of pBMSC . The results showed that : ( 1 ) The high expression of mi R - 17 / 21 / 143 could significantly increase the DNA methylation level of the promoter region of pBMSC . The results showed that : ( 1 ) The high expression of mi R - 17 / 21 / 143 could significantly inhibit the expression of polygenic gene Oct4 and Nanog . ( 2 ) The high - expression lentivirus vector of mi R - 375 was able to effectively clone p - BMSC into a positive cell clone . In the induction process , the expression of Oct4 gene was significantly decreased , and the expression of gene SOX17 increased and decreased again after the induction . The results showed that the cell had the ability to secrete insulin and C - peptide .

【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q813

【相似文献】