卷枝毛霉脂质积累机制的碳代谢流分析及关键基因改造

发布时间：2018-04-13 20:08

本文选题：卷枝毛霉 + 脂质积累　；参考：《江南大学》2016年博士论文

【摘要】：微生物油脂富含高价值的多不饱和脂肪酸,如花生四烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸、伽马亚麻酸等,且微生物油脂可以作为生产生物柴油的原料,因此,近年来微生物油脂受到人们的高度关注。产油丝状真菌卷枝毛霉是全球首次商业化生产微生物油脂的菌株,其生产的油脂富含多不饱和脂肪酸γ-亚麻酸(GLA)。卷枝毛霉CBS277.49的基因组序列已经公布,且具有较为成熟的转化系统,已经成为研究产油丝状真菌脂质积累机制的模式生物。产油酵母脂质积累的机制已有大量文献报道,但是产油丝状真菌卷枝毛霉脂质积累的机制还没有系统地分析和研究。本论文通过13C标记的代谢流量分析方法对产油丝状真菌卷枝毛霉脂质积累的碳代谢调控机制进行研究,并对影响其脂质积累的关键基因进行遗传改造。论文的主要研究内容和实验结果如下:卷枝毛霉CBS 277.49可以积累不超过自身细胞干重15%的油脂,而卷枝毛霉WJ11的总脂肪酸含量高达36%,为了研究卷枝毛霉不同菌株之间脂质含量差别巨大的分子机制,采用13C标记的代谢流量分析方法对两株卷枝毛霉在两种培养条件下脂质合成过程代谢反应网络中代谢流量的分布进行了研究。实验结果表明,与低产脂菌株CBS 277.49相比较,高产脂菌株WJ11中,磷酸戊糖途径和乙醛酸循环的流量显著增加,三羧酸循环流量降低;与高氮培养条件相比,低氮培养基培养卷枝毛霉WJ11和CBS 277.49时,其磷酸戊糖途径流量增强,三羧酸循环流量降低,乙醛酸循环流量亦有所增加;在高产脂菌株中,苹果酸酶和磷酸戊糖途径流量的增加能为其脂肪酸的合成提供更多的还原力NADPH,结果显示苹果酸酶和磷酸戊糖途径可能在卷枝毛霉的脂肪酸合成中占据重要的作用;同时ATP:柠檬酸裂解酶的活力亦有所增加,能为其脂肪酸的合成提供更多的底物乙酰辅酶A。将来自于磷酸戊糖途径中编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的基因在卷枝毛霉中分别过表达。在卷枝毛霉过表达重组菌株中,其葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的酶活力显著提高,且相应基因的转录水平也有所提高。与对照菌株相比较,高的酶活力及高的转录水平,使得卷枝毛霉过表达重组菌株的总脂肪酸含量提高了22-37%。实验结果表明,磷酸戊糖途径中的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶在卷枝毛霉的脂肪酸合成中具有重要的作用,是其脂肪酸合成所需还原力NADPH的重要提供者。为了研究苹果酸酶在卷枝毛霉脂肪酸合成中的作用,将定位于细胞质的两个苹果酸酶基因分别在卷枝毛霉中过表达。与对照菌株相比较,在过表达重组菌株中,尽管苹果酸酶的活力和苹果酸酶基因的转录水平有所提高,但是其脂肪酸含量并没有变化。实验结果表明,在卷枝毛霉的脂肪酸合成中,苹果酸酶可能并不是其限制性因素。为了研究苹果酸转运蛋白在卷枝毛霉脂肪酸合成中的作用,分别将卷枝毛霉中的苹果酸转运蛋白基因进行过表达和敲除。在苹果酸转运蛋白过表达重组菌株中,与对照菌株相比较,其总脂肪酸含量提高了70%,而敲除菌株的总脂肪酸含量降低了27%。在过表达重组菌株中,其细胞外的苹果酸浓度有所降低,而在敲除重组菌株中,其细胞外的苹果酸浓度有所增加。实验结果表明,苹果酸转运蛋白能够将细胞溶胶中的苹果酸转运至线粒体,进而可能增加线粒体内柠檬酸合成前体及提高柠檬酸的转运速率,从而促进卷枝毛霉脂肪酸的合成,苹果酸转运蛋白在卷枝毛霉的脂肪酸合成中占据重要的位置。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：TS201.3

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