高效家蚕丝腺生物反应器的关键因素分析

发布时间：2016-11-16 08:51

  本文关键词：高效家蚕丝腺生物反应器的关键因素分析，由笔耕文化传播整理发布。

《浙江大学》 2015年

高效家蚕丝腺生物反应器的关键因素分析

叶露鹏  

【摘要】：家蚕是鳞翅目昆虫的典型代表,作为第二大模式昆虫,它不仅有着重要的研究价值,而且可以带来可观的经济价值。转基因技术的成功建立是生命科学领域的里程碑,它频繁的被用于改变生物的性状以及通过这种技术在生物体中表达一些珍贵的外源蛋白。PiggyBac转座子是最具吸引力的转座原件之一,它已经广泛的被应用于十多种生物的研究。PiggyBac转座子介导的转基因技术为家蚕的转基因研究提供了坚实的基础。家蚕丝腺有着惊人的蛋白合成和分泌的能力,是一种非常理想的生物反应器。经过数十年的努力,研究人员已经创建了家蚕中部和后部丝腺生物反应器。这些生物反应器已经成功表达了数十种外源蛋白。然而,现有的家蚕丝腺生物反应器效率依旧不高,主要体现在piggyBac转座子介导的转基因效率低、外源蛋白表达量较低、以及理想的转基因阳性个体筛选较复杂等等,这几个问题成为了建立高效家蚕丝腺生物反应器所面临的最大障碍。因此,提高转基因效率、提高外源基因表达量以及创建一种快速外源基因高效表达的转基因阳性个体筛选方法显得尤为重要。本文就针对这些科学问题展开了一系列的研究,取得的主要成果归纳如下：1、类转录激活因子效应蛋白介导piggyBac转座子的高效转座针对piggyBac介导的转基因效率不高这个问题,本研究创建了一种有效提高转座效率的新方法,该方法的核心是构建一个类转录激活因子效应蛋白(transcription activator-like effector, TALE)和piggyBac转座酶(PBase)的融合蛋白(TALE-PBase)。实验证明TALE-PBase融合蛋白可以显著地将转座效率提高到63.9%,这相当于是目前转座效率平均水平的7倍。而且新方法的转基因阳性蛾区中的阳性个体数每区平均达到近18条,比目前家蚕转基因实验的平均水平最大提高了5.7倍。TALE-PBase融合蛋白介导的转基因技术不仅提高了转基因阳性蛾区数,而且也明显提高了阳性蛾区中的阳性个体数。这两方面的提高是piggyBac转座子介导的转基因技术的巨大突破,为今后的转基因研究提供了很好的技术支撑。2、家蚕丝胶1启动子的结构与活性分析启动子是调控目的基因时空表达重要的调控原件之一。然而,绝大多数的研究将目光放在了核心启动子或近端启动子区域,而近端启动子5’端的序列常常被人们所忽视。本研究就4kb长度的家蚕丝胶1 (sericin 1, Serl)启动子序列通过生物信息学方法预测到种类众多的潜在的转录因子结合位点,采用转基因实验发现启动子序列包含的转录因子结合位点越多且种类越丰富时,启动子的转录活性就越强大。但是重复的近端启动子多个拷贝组合并不能提高下游基因的转录水平,而且重复的近端启动子拷贝数越多,下游基因的转录水平反而越低。结果说明,4 kb长度的Serl启动子要比其短的启动子活性要高,重复的近端启动子多个拷贝组合并不能提高下游基因转录活性。这个结果为今后构建高效家蚕丝腺生物反应器时选择合适长度的启动子提供了参考。3、PiggyBac转座子在家蚕基因中的定向转座转座子的随机转座时常不利于外源基因的表达,而且可能会引起内源基因的突变。TALE-PBase融合蛋白介导的转座理论上有可能实现定向转座。PBase通过TALE靶向蛋白的牵引到达目的位点,从而在目的位点实现定向转座。通过研究我们发现了TALE-PBase介导的转座改变了piggyBac转座子原先完全随机插入的特性,而是变的更加具有倾向性,但还没有得到真正定向转座的结果。我们还在71个转座家蚕中发现了2对插入位点一样的家蚕,这种现象在常规的piggyBac转座研究中是非常罕见的。由此可见,TALE对PBase在一定程度上起到了靶向引导作用,这为今后在个体水平实现定点转座提供了宝贵的参考价值。4、TALEN介导的家蚕同源重组家蚕受精卵相当于家蚕的早期个体,相比细胞,它更能反应生命的真实情况。因此,用家蚕受精卵进行同源重组(homologous recombination, HR)实验可以反应个体水平同源重组的发生概率。同源重组精确的基因组编辑能力可以弥补其它基因组打靶技术的不足,而且也可以解决piggyBac转座子随机插入基因组这一问题。但同源重组的低效率现象是阻碍其广泛应用的一个限制因素。本研究采用蚕卵为材料,将TALEN mRNA和供体同源重组质粒注射到产卵8h的家蚕受精卵内,经72 h后进行TALEN打靶效率的鉴定以及同源重组效率的检测,结果发现TALEN在显微注射后72 h就已经对靶位点产生了明显突变,在检测的15组样品中有12组出现了明显打靶,打靶效率达到80%。并且在15组受精卵中成功检测到3组包含阳性的同源重组个体,同源重组效率达到20%。这种蚕卵早期的TALEN打靶效率以及同源重组效率的检测可以在短期内评判实验的可行性,为后续阳性同源重组个体的筛选提供保障。同时也证明采用TALEN mRNA和供体同源重组质粒组合可以实现精确的基因组编辑。5、外源基因表达效率的辅助检测虽然piggyBac转座子是以随机的方式插入基因组,但是将外源基因表达框和标志基因表达框以相同转录方向紧密的构建在一起时,我们相信即使在不同的插入位点,两个表达框受到来自基因组的影响是相近的。我们构建了萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, FLuc)和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, EGFP)两个相邻的基因,作了转录水平的相关分析,结果表明即使插入位点不同,这两个基因的转录水平总是显著相关的。ELISA实验进一步显示EGFP的转录水平和翻译水平同样也是显著相关。所以,外源基因的表达水平可以通过检测标志基因(EGFP)的表达水平来简单的预测。综上所述,本论文从提高转基因效率、提高外源基因的表达效率以及建立外源基因表达效率的辅助检测方法这3个层次来优化家蚕丝腺生物反应器并取得了相应的成果,为最终建立高效家蚕丝腺生物反应器奠定了坚实的基础。TALEN打靶效率以及同源重组效率的检测可以在短期内评判实验的可行性,为后续阳性同源重组个体的筛选提供保障。同时也证明采用TALEN mRNA和供体同源重组质粒组合可以实现精确的基因组编辑。

【关键词】：
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78;S881.2
【目录】：

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1 ;Expression of hIGF-I in the silk glands of transgenic silkworms and in transformed silkworm cells[J];Science in China(Series C:Life Sciences);2009年12期

2 ;Comparison of Transformation Efficiency of piggyBac Transposon among Three Different Silkworm Bombyx mori Strains[J];Acta Biochimica et Biophysica Sinica;2007年02期

3 ;Efficient and Specific Modifications of the Drosophila Genome by Means of an Easy TALEN Strategy[J];遗传学报;2012年05期

4 钟伯雄;危浩;庄兰芳;;piggyBac转座子介导的转基因家蚕丝腺生物反应器研究进展[J];中国农业科学;2011年21期

【共引文献】

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1 徐汉福;马三垣;王峰;刘耀文;夏庆友;;适用于实用家蚕品种转基因的蚕卵滞育解除方法[J];蚕业科学;2011年01期

2 胡莹莹;薛仁宇;曹广力;贡成良;;利用非转座子载体介导的转基因家蚕表达人胰岛素样生长因子Ⅰ[J];蚕业科学;2012年04期

3 李晓阳;郭学青;;人β干扰素基因定点突变及在sf9细胞中的表达和活性研究[J];国际检验医学杂志;2010年10期

4 高强;杨国梁;钟伯雄;王军毅;陈雪峰;危浩;庄兰芳;叶少群;杨浩;;piggyBac转座子介导的转基因叉尾斗鱼的构建[J];动物学杂志;2012年04期

5 刘丹梅;李文利;安利佳;;新型柞蚕双元基因转移载体的构建及在Sf9细胞中的表达[J];蚕业科学;2014年01期

6 刘丹梅;李文利;;Fluorescence Tracking of Exogenous DNA in Genetic Transformation of the Chinese Oak Silkmoth Antheraea Pernyi via Sperm-Mediated Gene Transfer[J];Journal of Donghua University(English Edition);2014年04期

7 林雅容;周淑芬;朱义旺;孙庆山;陈惠妹;王锋;;基因组编辑技术及其在植物遗传改良上的应用[J];福建农业学报;2015年05期

8 周启升;于奇;刘庆信;;转基因家蚕的研究进展及应用前景[J];昆虫学报;2011年02期

9 彭陈;王瑞;李万昌;郭士伟;;植物基因功能研究新方法[J];华北农学报;2014年S1期

10 吕志创;严盈;张桂芬;武强;刘万学;万方浩;;基因组编辑技术及其在昆虫遗传转化中的应用[J];生物安全学报;2015年02期

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1 邓党军;家蚕脂肪体特异启动子BmLSP、BmLP3的克隆、鉴定及应用[D];西南大学;2011年

2 李兴华;纤维素酶产生菌的筛选及纤维素酶基因在家蚕中的表达研究[D];浙江大学;2011年

3 庄兰芳;家蚕转基因载体元件的结构优化及在基因功能分析中的应用研究[D];浙江大学;2011年

4 刘晓勇;家蚕核型多角体病毒与家蚕抗病毒相关的蛋白质组分析[D];江苏大学;2009年

5 王娜;基于piggyBac转座子的家蚕定向遗传转化研究[D];浙江大学;2010年

6 陆叶;家蚕生物反应器表达hIL-28A及其抗肿瘤能力评价[D];苏州大学;2010年

7 胡小龙;家蚕BmDuox基因分析及中肠围食膜蛋白鉴定[D];浙江大学;2013年

8 刘丹梅;柞蚕新型转基因载体构建和精子介导转化研究[D];大连理工大学;2013年

9 叶建华;建立常染色体显性多囊肾病小型猪模型[D];中国农业大学;2014年

10 杨翌;应用类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）定点修饰猪基因组[D];吉林大学;2014年

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1 潘兴亮;家蚕丝腺生物反应器表达hIGF-Ⅰ转基因分泌表达载体的构建及其应用研究[D];苏州大学;2009年

2 范伟;家蚕脂肪体组织蛋白质表达差异分析及利用转基因技术构建抗BmNPV家蚕品种的探索[D];浙江大学;2009年

3 胡莹莹;非转座子载体介导的转基因家蚕的研究[D];苏州大学;2012年

4 张昊堃;Gai4/UAS转基因系统表达BmKIT_3~R对家蚕蛹期发育的影响[D];苏州大学;2012年

5 凌琳;低能Ar~+束介导的家蚕卵转基因技术研究[D];安徽农业大学;2012年

6 沈莹;敲降clock1a对斑马鱼per基因表达和运动行为节律的影响[D];苏州大学;2013年

7 宋作伟;过表达Bmovo-1对家蚕卵巢发育的影响及丝腺生物工厂分泌表达hIGF-I[D];苏州大学;2013年

8 殷亚娟;φC31-att介导的家蚕/细胞转基因及基于GAL4/UAS双元系统控制蛹期发育[D];苏州大学;2013年

9 云亭;利用锌指核酶技术制备MSTN基因敲除的牛胎儿成纤维细胞[D];内蒙古大学;2013年

10 骆晨;piggyBac转座子亚末端对转座活性的影响[D];南京农业大学;2013年

【二级参考文献】

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1 吴卫成;鲁华云;李建营;叶键;梁建设;陈金蛾;倪春霄;钟伯雄;;转基因家蚕实验用材料蚕的冷藏期限[J];蚕桑通报;2005年04期

2 徐汉福;幸俊逸;王职峰;夏庆友;;外源piggyBac转座元件在转基因家蚕中的整合位点分析[J];蚕学通讯;2010年01期

3 桂慕燕,叶向群,左正宏,吴春旭,陈元霖,羿红,朱明贞,林友照;应用精子载体法导入外源DNA影响家蚕遗传性的研究[J];蚕业科学;2003年04期

4 曹广力;薛仁宇;何泽;郑小坚;沈卫德;贡成良;;基于piggyBac转座子转hGM-CSF基因家蚕的研究[J];蚕业科学;2006年03期

5 张业顺;夏定国;张国政;唐顺明;沈兴家;赵浩勤;郭锡杰;;家蚕精子介导转基因技术体系的优化[J];蚕业科学;2007年02期

6 段建平;徐汉福;马三垣;邓党军;王峰;夏庆友;;人脑源性神经营养因子基因(hBDNF)在转基因家蚕丝腺中的特异表达[J];蚕业科学;2009年02期

7 唐顺明;沈兴家;赵巧玲;章扬;张国政;郭锡杰;;家蚕二化性品种(品系)转基因用蚕卵的预处理技术研究[J];蚕业科学;2009年04期

8 ;Expression of hIGF-I in the silk glands of transgenic silkworms and in transformed silkworm cells[J];Science in China(Series C:Life Sciences);2009年12期

9 马三垣;徐汉福;段建平;赵爱春;张美蓉;夏庆友;;家蚕转基因技术中若干因素对转基因效率的影响[J];昆虫学报;2009年06期

10 李春峰;黄科;甘进锋;蒙炳超;李智;夏庆友;周泽扬;;转植酸酶基因家蚕的制作及表达检测[J];昆虫学报;2009年07期

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1 陆德如;细菌转座子及其在分子遗传学中的应用[J];微生物学免疫学译刊;1984年01期

2 全登庄;可移动的遗传因子转座子及其效应[J];西北师范大学学报(自然科学版);1985年04期

3 傅荣昭，李文彬，孙勇如;植物转座子在基因工程应用上的研究进展[J];生物工程进展;1994年05期

4 李凤玲,赵毓橘;植物转座子[J];植物生理学通讯;2000年05期

5 何承忠,陈宝昆,江涛,张志毅,李善文;植物转座子的研究与应用[J];西南农业学报;2004年03期

6 王瑞白,阚飙;转座子插入位点的鉴定方法[J];生物技术通讯;2005年03期

7 高东迎;何冰;孙立华;;水稻转座子研究进展[J];植物学通报;2007年05期

8 韩民锦;李雪;张泽;;转座子显示技术及其在家蚕遗传进化研究中的应用展望[J];蚕学通讯;2008年04期

9 张博;陈兵;张青文;康乐;;昆虫的转座子及其功能[J];昆虫知识;2009年02期

10 田海霞;;转座子在基因组和基因进化方面的研究进展[J];安徽农业科学;2011年20期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 高才华;肖美丽;任小东;Alice Hayward;殷家明;付东辉;李加纳;;真核生物基因组中嵌合转座子的特征分析和功能注释[A];中国遗传学会第九次全国会员代表大会暨学术研讨会论文摘要汇编（2009-2013）[C];2013年

2 严冰;曾庆韬;钱远槐;;黑腹果蝇黑条体突变体中转座子分布的多样性研究[A];中国动物科学研究——中国动物学会第十四届会员代表大会及中国动物学会65周年年会论文集[C];1999年

3 张云峰;;小麦中转座子存在的可能性初探[A];中国细胞生物学学会第五次会议论文摘要汇编[C];1992年

4 曲志才;姜曰水;;山东部分地区灰飞虱mariner类转座子研究[A];中国遗传学会第八次代表大会暨学术讨论会论文摘要汇编（2004-2008）[C];2008年

5 周祥;白林泉;邓子新;;井冈霉素产生菌的全基因组转座子突变[A];2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集[C];2008年

6 逄晓阳;李晶;刘国文;王哲;;利用转座子诱变构建反刍月形单胞菌乙酸生成关键酶基因缺失工程菌[A];中国畜牧兽医学会2006学术年会论文集（上册）[C];2006年

7 瞿婷婷;俞云松;魏泽庆;陈亚岗;李兰娟;;万古霉素耐药肠球菌耐药转座子结构及MLST分型[A];2007年浙江省医学病毒学、医学微生物与免疫学学术年会论文汇编[C];2007年

8 何泽;曹广力;薛仁宇;陈淼;陈文柱;王崇龙;郑小坚;沈卫德;贡成良;;用piggyBAC转座子进行家蚕转hGM-CSF基因研究[A];中国蚕学会第四届青年学术研讨会会议论文集[C];2004年

9 钟仰进;杨婉莹;曹阳;黄亚东;温硕洋;劳海华;陈维春;;家蚕K1.4转座子的拷贝多态性及K1.4主拷贝的序列特征研究[A];中国的遗传学研究——中国遗传学会第七次代表大会暨学术讨论会论文摘要汇编[C];2003年

10 程洛单;邹曙明;田玉梅;杜雪地;;金鱼hAT家族Tgf2转座子在斑马鱼胚胎中的自我剪切[A];2012年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2012年

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1 冯卫东;[N];科技日报;2010年

2 本报记者 冯卫东;[N];科技日报;2008年

3 朴淑瑜;[N];科技日报;2010年

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1 叶露鹏;高效家蚕丝腺生物反应器的关键因素分析[D];浙江大学;2015年

2 刘东;多倍体鱼转座子的遗传变异和雌核发育鱼性腺发育的分子生物学研究[D];湖南师范大学;2009年

3 张化浩;家蚕基因组中转座子的水平转移[D];重庆大学;2014年

4 陈勇;全基因组中网络缺失基因和微型转座子的发现及研究[D];山东大学;2008年

5 马赑;桑树全基因组转座子的鉴定及特征分析[D];西南大学;2014年

6 丁昇;piggyBac转座系统[D];复旦大学;2007年

7 王娜;基于piggyBac转座子的家蚕定向遗传转化研究[D];浙江大学;2010年

8 吴敏;鳞翅目昆虫中piggyBac转座子研究[D];南京农业大学;2008年

9 胡广东;piggyBac转座系统的改造及其介导的牛核移植转基因供体细胞生产[D];西北农林科技大学;2014年

10 韩民锦;家蚕MITE转座子的鉴定、进化和功能以及家蚕转座子的进化动力学研究[D];西南大学;2013年

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1 高杰;家蚕内源性piRNA促进家蚕piggyBac转座子的稳定性[D];西南大学;2015年

2 杨晶晶;组织培养诱导下水稻met1-2突变体反转座子Tos17活性与组蛋白修饰关系研究[D];东北师范大学;2015年

3 周家庆;不同转座子在猪和鼠胎儿成纤维细胞中转座活性的比较研究[D];扬州大学;2013年

4 谢雨琇;多转座子载体的构建及其在哺乳动物细胞和胚胎中转座活性研究[D];扬州大学;2013年

5 刘玉博;利用转座子插入突变筛选高效产油菌株[D];河南农业大学;2009年

6 张陆;猪源多重耐药大肠杆菌转座子的流行及其接合共转移分析[D];东北农业大学;2014年

7 邓平;深红红螺菌高产氢突变株的筛选及转座子插入位点分析[D];西南大学;2008年

8 唐江涛;细菌转座子Tn5gusA5在野油菜黄单胞菌8004中转座规律分析及生物学验证[D];广西大学;2003年

9 谢飞;“睡美人”转座子系统对于外源基因整合和表达促进作用[D];扬州大学;2008年

10 何姗;表达猪端粒酶反转录酶转座子载体的构建及其在猪细胞永生化中的应用[D];扬州大学;2014年

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