缓解氧化应激Lactobacillus fermentum L8的筛选及益生机制研究

发布时间：2018-04-18 16:40

本文选题：乳酸菌筛选 + 发酵乳杆菌　；参考：《扬州大学》2016年博士论文

【摘要】：机体衰老及很多慢性疾病如糖尿病、癌症、肝硬化、动脉粥样硬化等发生都与体内自由基过度产生有关,临床表明通过膳食补充抗氧化物质可清除体内过多产生的自由基,维持机体氧化与抗氧化系统的平衡。随着“人类肠道元基因组计划”的实施,乳酸菌缓解氧化应激、辅助降胆固醇及调节肠道菌群等益生功能已成为当今生命科学研究热点。因此,基于人源肠道微生态,筛选具有突出缓解氧化应激能力的益生菌,阐明益生菌对机体氧化应激损伤的保护效应及相关机制,开发具有缓解氧化应激损伤的功能性益生菌株,具有一定的理论研究价值,也是制备高品质发酵剂及发酵产品的关键。本论文根据江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室建立的体外抗氧化功能益生菌的筛选模型,从江苏如皋长寿人群肠道内分离、筛选、鉴定、获得发酵乳杆菌(Lactobacillus ferrmentwmL8),建立酒精性肝损伤氧化应激及高脂膳食诱导氧化应激两个动物模型,综合运用考察L.fermentumL8对模型大鼠缓解氧化应激的抗氧化效应及关键指标水平变化的相关性分析,以期从分子、细胞和基因水平上阐明L.fermentumL8对氧化应激损伤的拮抗规律及相关作用机制,为益生菌高效利用及相关功能食品开发提供理论和技术支持。1.具有优良抗氧化功能特性益生菌株的体外筛选通过分析实验室初筛的江苏如皋长寿人群体内分离得到30株人源乳酸菌发酵液的羟自由基(OH·)、DPPH自由基的清除能力和还原能力,初步筛选出抗氧化活性较高的9株菌株。其中L8对OH·的清除能力为69.96%,对DPPH ·清除能力为85.27%,还原力A700nm为2.85,研究发现菌株对· OH、DPPH ·清除能力及还原能力三个指标之间没有相关性,表明菌株发挥抗氧化作用物质基础不相同。研究进一步发现9株菌发酵液的不同组分(发酵上清液、菌体和胞内提取物)均具有抗氧化特性,但不同组分的抗氧化特性有一定差异,其中发酵上清液的自由基清除能力和还原能力均显著高于菌体和胞内提取物(P0.05);发酵液的抗氧化能力与其各组分抗氧化能力之和并不相等。综合比较确定4株目标菌株,考察了37℃C培养24 h的SOD及GSH-Px活性,其中 L8最高的 SOD 为33.4U/mL,GSH-Px 为38.2 U/mL。通过人工模拟胃、肠道环境,进一步研究4株乳酸菌的耐酸耐胆盐能力,并研究其体外降胆固醇能力。结果表明,菌株L8在pH值为2.0和3.0的模拟人工胃液中培养3h的存活率分别为37.01%和68.55%,5h后存活率分别为10.28%和23.39%;在模拟人工肠液中1.5 h后的存活率为66.45%,3 h后的存活率为46.84%;在0.1%,0.3%及0.5%胆盐环境中的耐受力分别为24.11%,20.31%和19.92%;在0.1%的胆盐质量分数下其对胆固醇降解率最高为63.73%。研究进一步发现0.1%的胆盐浓度是L8发挥降解胆固醇效应的最佳浓度。研究发现菌体发酵上清液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌这3种致病菌均有一定抑制能力,通过调整pH排除抑菌物质是酸,通过热处理排除抗菌物质是蛋白质,通过不同蛋白酶处理后推论抑菌活性物质可能是一类热稳定小分子多肽类细菌素说明菌株L8具有潜在的抗氧化、耐酸、耐胆盐及降解胆固醇特性。2.乳酸菌L8的鉴定及应用基础研究经生理生化、API80CHL及16SrRNA测序鉴定,将菌株L8鉴定为发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum,和标准菌株 L.fermentum CECT5716的同源性达到 100%。研究L.fermentumL8生长、发酵特性,发现菌株在培养4h后进入对数生长期,在10h到达稳定期,34h后数量开始略微下降;发酵乳的组织状态细腻,凝乳时的酸度变化较小;经5次传代后凝乳时间和酸度较为稳定,后酸化较弱,粘度上升较大,说明该菌株发酵稳定性较好。L.fernmentum L8表面疏水性及对IEC-6细胞的黏附能力较强,和阳性对照BB-12相近,有助于其在体内发挥其益生作用。L.fermentum L8的耐药谱相对较窄,对妥布霉素、阿米卡星、万古霉素和卡那霉素具有一定的耐受性,对青霉素G、氯霉素、哌拉西林较为敏感。3.L.fermentum L8对大鼠急性酒精性肝损伤的保护的实验研究成功建立慢性酒精性肝损伤大鼠模型,用不同浓度L.fermnenturL8发酵液进行干预。测定各组大鼠的体重、脏器指数、血清、肝匀浆生化指标,并采用流式细胞仪测定了各组肝细胞Nrf2蛋白表达量和肝细胞凋亡百分数。结果表明:L.fermentumL8干预后,大鼠体重增长较快,肝指数也恢复至正常水平;L.fermentum L8的干预能显著降低大鼠血清的内毒素含量(P0.05),说明L8在肠道的黏附降低了肠道黏膜的通透性,降低血液中的内毒素含量;与模型组相比,高浓度L.fermentum L8组能显著降低血清ALT、AST水平(P0.05),升高SOD含量(P0.05),显著升高肝匀浆SOD、GSH和GSH-Px含量(P0.05),降低MDA水平(P0.05);表明L.fermentum L8能通过减轻脂质在肝脏积聚,清除自由基、缓解氧化应激,有效减轻自由基对细胞膜的损伤;与模型组相比,高浓度L.fermentum L8能显著升高大鼠肝脏ADH、Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase 含量(P0.05);显著降低大鼠肝脏 TNF-α、IL-6、VEGFTGF-β1、和 NF-κB等炎性因子的表达水平(P0.05);大鼠肝脏的Nrf2蛋白表达量显著升高(P0.05);肝细胞凋亡百分数显著降低(P0.05)。相关性分析表明L.fermentum L8可能通过加快线粒体电子呼吸链传递速度和提高氧化磷酸化效率保证了线粒体膜ATP酶所需能量的供应,以及增加细胞内GSH等氧化酶的水平,达到提高抗氧化能力、抑制促炎因子、减轻肝损伤的炎症反应、减少干细胞的凋亡,进而起到缓解氧化应激能力的效应。4.L.fermentu L8缓解高脂膳食诱导的氧化应激实验研究利用高脂膳食饲喂大鼠诱导氧化应激模型,评价L.fermentum L8在体内缓解高脂膳食诱导的氧化应激的能力。研究结果表明,L,fermentum L8能缓解高脂膳食诱导的大鼠血液和肝脏中产生的氧化应激。与模型组相比,L.fermentum L8干预均能显著改善大鼠的脏体系数(P0.05);而与对照组则无显著性差异(P0.05);显著降低大鼠的血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、ALT、AST、高密度脂蛋白(HDL)、动脉粥样硬化指数(AI)、抗动脉粥样硬化指数(AAI)水平(P0.05);显著提高血清SOD酶活性(P0.05);显著提高肝匀浆GSH、GSH-Px水平(P0.05)。与模型组相比,L,fermentum L8干预能显著降低(P0.05)高脂膳食诱导氧化应激模型小鼠肝脏胆固醇的水平;粪便中胆固醇和胆汁酸的水平(P0.05);显著增加了大鼠结肠内容物T-AOC的含量(P0.05);显著降低了大鼠结肠内容物MDA的含量(P0.05);肝细胞凋亡百分数显著降低(P(0.05);电镜透视发现,受损大鼠的肝脏、心脏组织结构得到改善。高脂膳食摄入引起模型小鼠肠道菌群发生改变,降低了大鼠肠道拟杆菌门的含量,同时增加了厚壁菌门的含量,而在干预L.fermentum L8及其发酵乳4周后,增加了大鼠肠道拟杆菌门的含量,降低了厚壁菌门的含量。L.fermentum L8及其发酵乳干预增加了大鼠肠道乳酸菌及双歧杆菌的含量,降低大肠杆菌的含量。逆转了高脂膳食饲喂小鼠的肠道菌群变化。相关性分析表明:结肠内容物的MDA水平与大肠杆菌丰度显著正相关(P0.05),与乳酸菌、双歧杆菌显著负相关(P0.05)。而结肠内容物的T-AOC与乳酸菌丰度显著正相关,但与大肠杆菌丰度显著负相关(P0.05)。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：TS201.3

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