胸膜肺炎放线杆菌转录图谱和蛋白质互作网络的构建与分析

发布时间：2018-04-19 05:19

  本文选题：胸膜肺炎放线杆菌 + RNA-seq技术　； 参考：《华中农业大学》2016年博士论文

【摘要】：猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia,PCP)是一种具有高度接触性的猪呼吸道传染病,给全世界养猪产业造成了巨大的经济损失。其病原胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae,APP)是巴斯德菌科放线杆菌属的一种革兰氏阴性小杆菌。APP基因组序列的注释工作是通过基于基因预测、计算机算法等生物信息学方法来实现的。由于计算机方法在原核生物基因注释方面固有的局限性,目前对APP基因组的注释远未完成。应用高通量RNA-seq技术进行细菌转录组分析,能够准确有效的发现基因表达区和未知的转录单位,尤其能够用于sRNA、UTR和调节功能元件的鉴定。蛋白质作为生命活动的主要执行者和功能载体,通过蛋白质相互作用行使复杂的生物功能,参与了生物体内几乎所有的生物过程。研究蛋白质的相互作用有助于理解生物体尤其是致病菌各项生命活动的机理,并能为抗菌药物提供新的靶标。目前,APP蛋白质相互作用的数据非常匮乏,这极大的限制了对APP的基因功能、调控机理、致病机制和药靶筛选等研究。本研究一方面采用RNA-seq技术对APP进行了全面的转录组分析,对现有的基因组注释进行了完善,并对APP的基因结构和转录调节单元进行了详细的分析鉴定。另一方面,采用同源映射的方法构建了APP蛋白质互作网络,并挖掘了未知蛋白的功能,揭示了新的蛋白质相互作用,从蛋白组水平分析了APP的信号调控机制,预测了潜在药物靶标。取得的主要研究结果如下:1.APP单碱基分辨率转录图谱的构建与分析通过对RNA-seq获得的reads的质量评估与APP基因组匹配并统计分析,匹配到基因组的reads数为38,568,297,reads的长度为90bp,得到的总碱基数为3,723,758,460,得到样品的测序数据大小为3.5Gb,相当于基因组覆盖深度的1700倍,表明本研究所获得的转录组测序数据具有较高的质量和分辨率,能够很好地反应APP基因组的转录状况,并能对低丰度的转录本进行鉴定,进而成功绘制了APP全基因组水平的单碱基分辨率转录图谱。鉴定出APP基因组注释2147个基因中共有1933个基因是转录的,并对其表达量进行了标准化的RPKM计算。对转录产物对应的蛋白质进行了cog分析,发现转录的基因分布在所有的cog功能分类中。同时鉴定出2325个转录的基因间区区域。依据rna-seq数据,对原有的app基因组注释进行了优化。在app中共鉴定出32个新基因,最短的编码26个氨基酸,最长的编码90个氨基酸,平均大小约为47个氨基酸。通过转录图谱对现有基因组注释的35个基因的起始位置进行了矫正。通过rna-seq数据共预测出1946个utr。其中847个utr位于app操纵子内部,无法明显区分utr的边界。其余1099个utr位于app操纵子外部。对找到的具有5’-utr和3’-utr相应的基因进行cog功能分析,并分析了不同cog功能分类基因的utr长度分布。可以发现信号转导相关基因的utr最长,而dna复制、重组、修复,翻译、核糖体结构和转录相关基因的utr较短。筛选出app中的51个候选srna,通过将鉴定出的所有候选srna序列,比对rfam数据库,鉴定出11个在其他物种中保守的、有明确注释功能的srna。鉴定出由840个共表达基因对(共1230个基因)组成的351个独立的操纵子,并通过rt-pcr对其中随机选取的26个操纵子的40对共表达基因对进行了验证。上述研究结果不仅证实了app注释基因的转录情况,对原基因组注释进行了矫正,使得当前的基因组注释更加完善准确,并且发现了较多新的功能元件(例如新的蛋白,非编码srna,操纵子结构),为该病原菌基因功能、转录调节机理和致病机制的研究奠定了基础。2.app蛋白质互作网络的构建与分析基于同源蛋白映射的方法,利用app基因组全部的蛋白质编码信息,以及从数据库下载的蛋白质相互作用数据,构建了app蛋白质互作网络。互作网络共包括2737对非冗余蛋白质互作对,共涉及553个蛋白质。所包含的蛋白分布在所有的cog功能分类中,极显著富集的cog功能类为j类(翻译、核糖体结构、生物合成)、e类(氨基酸的运输与代谢)和s类(功能未知的蛋白质)。利用cytoscape软件对app蛋白质相互作用网络的拓扑结构与属性进行分析,发现app蛋白质互作网络具有小世界性和无尺度网络的性质,这样的蛋白质相互作用网络具有良好的容错性和稳定性,而且信息传递速度快,可以对外界压力变化迅速作出响应,能够在环境突发压力下展现出较高的耐受力。构建了hns蛋白质的互作子网络,并对其包含的所有16对蛋白质相互作用关系通过细菌双杂交的方法进行实验验证,证实本研究构建的网络的可靠性。通过APP蛋白质互作网络中与假设蛋白存在互作关系的功能已知的蛋白质对23个假设蛋白进行了蛋白质功能预测。APP蛋白质互作网络中有131个蛋白质存在于KEGG通路数据库中全部32条生物通路中,生物通路中复杂的蛋白质相互作用关系使得APP生物途径中的少数蛋白质,当在外界压力下表达受到抑制,生物途径并不会终止,而是可以通过其他替代蛋白质行使功能继续完成该生物途径。进一步构建由胞壁合成与嘧啶代谢通路相关的蛋白质互作子网络,进行APP中药物靶标的预测。从全局角度结合蛋白质数据库和参考文献,确定已知药物靶标22个,有文献报道的潜在药物靶标13个,新的候选药物靶标18个。对信号传导类蛋白互作网络也做了进一步分析。APP全基因组中,参与机体信号传导的蛋白共有38个,在本研究所构建的APP蛋白质互作网络中参与信号传导的蛋白共有15个,相互作用的比例为39.5%。构建了信号转导类蛋白质互作子网络,并对信号转导类蛋白和转录类蛋白通过相互作用所参与的信号转导途径进行了分析,发现APP中存在T类信号传导蛋白和K类转录因子蛋白的相互作用,例如Crp蛋白与RpoA、RpoD和PurR蛋白互作,共同调控下游基因的表达。说明APP中存在复杂的信号传导和基因调控模式。这些研究结果预测了新的APP蛋白质功能,从蛋白组水平初步揭示了APP的代谢网络和信号传导模式,为APP基因功能、信号交流与基因调控、环境适应与致病机理的研究提供了丰富的数据基础。
[Abstract]:On the one hand , the genetic function , regulation mechanism , pathogenic mechanism and target screening of APP have been analyzed by using high - throughput RNA - seq technology .

【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
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本文编号：1771748