Stenotrophomonas maltophilia角蛋白酶的分子改造

发布时间：2018-04-29 06:35

  本文选题：角蛋白酶 + 嗜麦芽窄食单胞菌　； 参考：《江南大学》2017年博士论文

【摘要】：角蛋白酶(keratinase)是一种可以特异性降解角蛋白底物的水解酶,在饲料、洗涤、皮革以及医药行业有着巨大的潜在应用价值。但目前角蛋白酶产量低和酶学性质差,严重阻碍了角蛋白酶的商业化开发和工业化应用。为实现角蛋白酶工业化生产及应用,本研究筛选获得一株能高效降解羽毛废弃物的嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)BBE11-1,通过摇瓶和发酵罐发酵水平的优化,提高角蛋白酶产量,并对酶进行纯化和酶学性质解析;在此基础上,进一步鉴定角蛋白酶基因,构建其异源表达系统,通过理性改造提高角蛋白酶性能。主要研究成果如下:(1)角蛋白酶生产菌的筛选和发酵优化从无锡市马山家禽养殖场筛选得到一株以羽毛作为唯一碳氮源的S.maltophilia BBE11-1,在其发酵液中测得明显的角蛋白酶活力。在摇瓶水平上,通过单因素、Plackett Burma及响应面分析等实验,确定发酵培养基为:1.5 g?L-1天冬氨酸,1.45 g?L-1大豆蛋白胨,4.25 g?L-1葡萄糖,10 g?L-1羊毛,1 g?L-1 K2HPO4,1 g?L-1 KH2PO4,1 g?L-1 Na Cl,100μl?L-1吐温20,初始p H 9.0,23°C,200 rpm摇床培养48 h。在3 L罐中,采取多种发酵策略(温度转化策略、溶氧控制策略和葡萄糖流加策略),S.maltophilia的角蛋白酶活力由优化前的145.2 U?ml-1提高到1282.7 U?ml-1,发酵时间从48小时缩短到18小时。将上述发酵过程放大至30 L罐,发酵18小时角蛋白酶活力达到1728 U?ml-1,比摇瓶水平的生产力提高32倍。此外,发酵液中必需氨基酸含量较高,具有开发有机肥料或者饲料添加剂的潜力。(2)角蛋白酶分离纯化及性质解析S.maltophilia发酵上清液依次经疏水柱、离子交换柱及凝胶柱纯化,分离得到三种和角蛋白降解相关的蛋白,其中两种蛋白具有角蛋白酶活性,分别命名为Ker SMD和Ker SMF。蛋白质N端测序分析显示,Ker SMD和Ker SMF的N端氨基酸序列分别为LAPNDPYYQQ和LTPNDTRFSE。基于S.maltophilia基因密码子偏好性,根据N端氨基酸序列设计简并引物,采用热不对称PCR方法筛选得到S.maltophilia BBE11-1基因组中的角蛋白酶基因ker SMD(1905 bp)和ker SMF(1743 bp)。以p ET质粒为载体,将上述角蛋白酶基因表达于大肠杆菌BL21(DE3),在重组菌上清液中均检测到角蛋白酶活性。其中Ker SMD的角蛋白酶活性是Ker SMF的三倍;Ker SMD在50?°C半衰期是Ker SMF的9倍,所以Ker SMD更加稳定。(3)角蛋白酶C端结构功能解析蛋白酶的C端结构往往和底物特异性相关,本研究还发现角蛋白酶Ker SMD的C端结构具有自我剪切特性。为研究C端结构对酶学性质的影响,以β-折叠的二级结构为单位对C端进行逐步缺失,分别得到突变体V456,V455,V435,V415,V395,V380,V370和V355。发现整个C端缺失的突变体V355对胶原蛋白降解活性低,在强碱(p H12)下表现出40%的相对酶活,在高盐(15%,w/v)环境下表现出60%的相对酶活,以及在高浓度(4%,w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)下表现出48%的残余酶活,在洗涤剂和皮革加工中具有较大应用潜力。V380、V370和V355在60?°C下的角蛋白酶活性提高1.7倍;其中V456在60°C下保温90 min拥有将近70%的酶活,较野生酶提高20%。模拟结构分析表明,V456的催化中心位点的空间距离和氢键数量都变少,可能增强了催化三联体的相互作用力从而增加了该突变体的热稳定和嗜热性;V355催化三联体上端形成的弱负电荷环状结构增强了催化活性中心与SDS的静电斥力,可能是SDS耐受力增强的重要原因。上述结果表明,C端结构可通过调节催化活性中心的作用力来影响Ker SMD底物特异性以及抗逆性能。(4)结构域重组提高角蛋白酶Ker SMD催化活性及热稳定性氨基酸序列比对和蛋白模拟结构分析显示Ker SMD和Ker SMF具有独立的N端前导肽和C端结构。采用N/C端结构域重组的策略,构建并成功获得基于Ker SMD催化区域的突变体DDF、FDD、FDF、DD和FD。与野生酶相比,DDF比酶活(角蛋白酶活性)提高500多单位,达到3909±45 U?mg-1,催化速率kcat/Km也增长54.5%。FDF60°C半衰期达到244.6?±?2 min的,是野生型的5.9倍;此外,FDF在p H 8.0-12.0条件下的活性比野生酶提高了12%,上述性质有助于FDF在皮革以及洗涤剂等行业的应用。蛋白模拟结构显示新的结构域的引入主要改变了底物结合口袋形态,说明角蛋白酶C端结构可以调节底物结合口袋大小来影响角蛋白酶的底物催化特性;而N端前导肽则是通过辅助蛋白折叠和加速成熟的特殊功能来实现角蛋白酶的高催化活性和热稳定性。(5)分子改造S1口袋提高Ker SMD催化活性根据以上研究,发现Ker SMD的催化活性与底物结合口袋S1构象变化有关。晶体结构和氨基酸序列分析显示,S1口袋中主要存在四个差异氨基酸(Ser180、Glu208、Tyr215和Arg216),对其疏水性或者侧链短小氨基酸的定点突变,发现Tyr215位点对于Ker SMD的催化活性影响最大,其中Y215G表现出最高催化速率(365 s-1·m M-1)。然后对Tyr215位点进行饱和突变,发现合适的侧链空间体积和疏水性有助于Ker SMD催化活性的提升。为进一步优化S1口袋构象,对三个位点Ser180,Glu208和Tyr215进行组合突变:S180G/Y215S表现出最高角蛋白酶活性(4800±138 U?mg-1);突变体S180G/Y215A的K:C比值(角蛋白比酶活:酪蛋白比酶活)为所有突变体中的最大值,将近4.5。另外,还检测到Y215S,Y215G和S180G/Y215S具有嗜热性,其中Y215S在70°C下角蛋白比酶活(7000 U·mg-1)比野生酶提高了2倍。蛋白模拟结构显示,合适的S1口袋大小和疏水性可以促进角蛋白酶水解能力。采用大肠杆菌对角蛋白酶突变体S180G/Y215S进行高效表达和发酵条件研究,采用碳源流加和生长后期诱导策略,从摇瓶的400 U?ml-1酶活提升到3 L发酵罐中的4500 U?ml-1,比原始产量提升了11.25倍。
[Abstract]:瑙掕泲鐧介叾(keratinase)鏄�涓�绉嶅彲浠ョ壒寮傛，

本文编号：1818828