母源BTG4在小鼠早期胚胎发育中的功能和机制研究

发布时间：2018-05-12 19:12

  本文选题：母源mRNA + CCR4-NOT复合体　； 参考：《中国科学技术大学》2017年博士论文

【摘要】：母源mRNA降解是小鼠卵母细胞成熟和早期胚胎发育过程中的重要事件。然而,我们对调节哺乳动物母源mRNA降解的因子和机制的了解还太少。一般而言,mRNA去腺苷酸化是非常重要的一个分子事件,是mRNA降解的第一步也对降解起到限速的作用。负责mRNA去腺苷酸化的主要是CCR4-NOT(CCR4-NOT transcription complex)复合体。在 CCR4-NOT 复合体中,Cnot6/6L和Cnot7/8具有核酸酶活性,它们担负着去腺苷酸化功能。然而,CCR4-NOT复合体中并没有RNA结合蛋白,其发挥去腺苷酸化功能需要其它的RNA结合蛋白或桥接蛋白来介导。在体细胞中,BTG/TOB(B-cell translocation gene/TransducerofERBB2)抗增殖蛋白家族作为桥接蛋白,在介导CCR4-NOT复合体调节mRNA去腺苷酸化及随后的降解过程中发挥着重要的作用。虽然BTG/TOB蛋白家族对mRNA去腺苷酸化具有重要功能,但是已经报道的五个成员(Tob1、Tob2、Btg1、Btg2、Btg3)的基因敲除鼠都具有正常的生存能力和生育力。另外,根据已经发表的基因表达数据库,相比于这五个成员Btg4(B-cell translocation gene 4)特异性高表达在小鼠卵母细胞和早期胚胎中。提示Btg4可能参与小鼠母源向合子转变过程中母源mRNA的降解。本项目利用基因敲除小鼠研究了Btg 在母源向合子转变过程中的功能和作用机制。实时定量RT-PCR结果显示Btg4特性高表达与卵巢和睾丸中,在卵母细胞和早期胚胎中呈现母源表达模式;有意思的BTG4蛋白主要表达在卵母细胞成熟以后到1-细胞阶段,提示其可能在母源向合子转变阶段发挥着重要功能。为研究Btg4的生理功能,本研究建立了该基因的敲除小鼠。Btg4敲除不影响小鼠的生存能力和雄鼠的生育能力,但导致雌鼠不育。Btg4缺失并不影响雌鼠的排卵和卵母细胞的成熟,但母源Btg4敲除却导致早期胚胎发育阻滞。借助于高通量转录组测序,Btg4敲除后,GV期卵母细胞没有明显的差异,而MII期卵母细胞和合子的转录组发生的明显差异:母源mRNA降解受到阻止,相对于野生型,上调的比例分别是46%(6401/13770)和20%(2898/14058)。同时,选择一部分有代表性的母源基因,利用qRT-PCR技术对它们的高通量测序结果进行了验证。为了进一步探索BTG4缺失后导致母源mRNA上调的原因,利用Poly(A)尾巴长度检测方法(PAT,Poly(A)tail length assay),Btg4敲除的MII期卵母细胞和合子不能去腺苷酸,因而降解受到阻止。另外,通过共免疫沉淀实验得出结论,BTG4 能够将 CCR4-NOT 复合体募集到 PABPC1L(Embryonic poly(A)-binding protein)(一种特异性表达在卵母细胞中的poly A结合蛋白),从而调节母源mRNA的降解。将BTG4蛋白中的两个保守的基序(BoxA和B)删除后,影响了 BTG4与CNOT7的相互作用。最后,Btg4挽救实验表明:只有全长的BTG4才能恢复BTG4缺失导致的异常表型。综上所述,我们的结果证实:在小鼠MZT(Maternal to zygotic transition)过程中,Btg4是母源mRNA降解的一个重要的调节子;并且BTG4是通过连接CCR4-NOT复合体与PABPC1L来发挥这一调节功能的。另外,我们的研究一方面增加了对小鼠母源向合子转变过程中分子调控机制的理解,同时相关的研究还可为人类不孕不育等发病机制提供参考。
[Abstract]:In the CCR4 - NOT complex , BTG / TOB ( BTG / TOB ( Btg1 , Btg2 , Btg3 ) plays an important role in the transformation of mouse oocytes and early embryos . 鍥犺，

本文编号：1879808