日本三角涡虫Neurotrophin信号通路关键基因及flotillins基因的克隆及功能分析

发布时间：2018-05-17 05:37

  本文选题：日本三角涡虫 + 再生　； 参考：《河南师范大学》2016年博士论文

【摘要】：日本三角涡虫(Dugesia japonica)隶属扁形动物门(Platyhelminthes),涡虫纲(Turbellaria),在动物系统演化中占有重要地位,并且涡虫具有极强的再生能力。目前,虽然已克隆大量与涡虫再生相关的基因,但其再生机制及相关基因的功能仍不清楚。本文利用RACE技术、Real-time PCR技术、整体原位杂交技术、免疫荧光技术以及RNA干扰技术对日本三角涡虫神经营养因子信号通路(Neurotrophin signaling pathway)关键基因Djras、Djshc、Djakt、Djmek1、Djmek2的cDNA全长进行扩增,并对五基因以及Djflotillins基因进行时空表达模式和功能分析,结果如下:(1)首次克隆了日本三角涡虫Djras基因的cDNA全长,共1219 bp,最大开放阅读框(ORF)为555 bp,编码一个由184个氨基酸残基组成的蛋白质,该蛋白包含鸟苷酸结合域、GAP作用位点和GEF作用位点三个保守的基序以及一个Caa X模块;进化分析表明Ras蛋白在不同的物种间高度保守,DjRas蛋白在进化上较其他扁形动物更为原始。Real-time PCR结果表明:Djras基因在涡虫切割去头后呈上调表达趋势,特别是在再生1、7天显著上调;整体原位杂交结果显示:Djras基因在涡虫头部脑神经节周围及肠支表达,在再生芽基部位强烈表达;干扰Djras基因后延缓涡虫头再生,并显著抑制涡虫正常尾再生。以上结果表明Djras基因在涡虫再生过程中起着关键调控作用。(2)首次克隆了Djshc基因的cDNA全长,共1728 bp,最大开放阅读框(ORF)为750 bp,编码一个由249个氨基酸残基组成的蛋白质,该蛋白质包含PTB和SH2结构域;进化分析表明Shc蛋白质在不同的物种间相对保守,扁形动物门的shc基因在进化上较原始。Real-time PCR结果表明:Djshc基因在涡虫切割去头后第1、7天呈上调表达趋势;整体原位杂交结果显示:Djshc基因在整体涡虫身体两侧及肠支部位表达,在再生涡虫芽基部位强烈表达;RNA干扰结果表明:Djshc基因干扰后部分涡虫头再生尾受到抑制,并且整体涡虫以及再生头都均出现多眼点畸形。以上结果表明:Djshc基因能够调控眼点正常分化且参与涡虫再生。(3)首次克隆了日本三角涡虫Djakt基因的cDNA全长,共2067 bp,最大开放阅读框(ORF)为1758 bp,编码一个由585个氨基酸残基组成的蛋白质,该蛋白质包含三个保守结构域;进化分析表明Akt蛋白在不同的物种间高度保守,akt基因在扁形动物中具有同一起源。Real-time PCR结果表明:Djakt基因在涡虫切割去头后1天显著上调表达;整体原位杂交结果显示:Djakt基因在涡虫再生前期的芽基部位以及再生后期的芽基基部强烈表达;干扰Djakt基因后抑制涡虫头再生尾。以上结果表明Djakt基因参与涡虫再生及身体重塑。(4)首次克隆了日本三角涡虫Djmek1/2基因的cDNA全长,其中Djmek1基因的cDNA全长共1721 bp,最大开放阅读框(ORF)为1419 bp,编码一个由472个氨基酸残基组成的蛋白质;Djmek2基因的cDNA全长共1743 bp,最大开放阅读框(ORF)为1278 bp,编码一个由425个氨基酸残基组成的蛋白质;两蛋白都包含一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化域以及一个保守的Ser-X-Ala-X-Ser基序;进化分析表明Dj Mek1和DjMek2氨基酸序列的同源性为48%,Dj Mek2较Dj Mek1蛋白保守性更高;两基因的Real-time PCR结果表明:Djmek1基因在涡虫切割去头后第1天呈显著上调表达,第5天下调表达;Djmek2基因在涡虫切割去头后第1、7天呈上调表达趋势;整体原位杂交结果表明:两基因表达部位相似,都在涡虫的肠支和再生芽基部位表达;RNA干扰结果显示:单独干扰任何一个基因涡虫没有显著形态变化,两基因同时干扰后出现再生速度慢、歪尾及尾缺刻等畸形。以上研究结果表明:两基因在日本三角涡虫中具有相似的功能且具有互补性,在涡虫再生过程中起着重要作用。(5)Djflotillins基因整体原位杂交结果表明:两基因在整体涡虫中除中枢神经系统和咽部外广泛表达,在再生涡虫的芽基部位表达;RNA干扰结果表明:Djflotillin-1干扰后整体涡虫出现耳突收缩,头部钝圆等畸形,且抑制再生或再生速度变慢;Djflotillin-2干扰后整体涡虫无显著变化,但是在尾再生头过程中再生速度减慢;同时干扰两基因后其结果与Djflotillin-1干扰后相似;两基因干扰后都出现胞吐及运动速度显著变慢现象。免疫荧光结果表明:两基因干扰后中枢神经系统再生正常。以上结果表明:1)Djflotillins基因与涡虫再生相关,但并没有参与涡虫中枢神经系统的功能维持与再生;2)Djflotillins基因可能通过调节肌动蛋白细胞骨架促进涡虫的运动;3)Djflotillins基因与涡虫吞噬作用相关。
[Abstract]:In this paper , the full - length cDNA of Djras gene was amplified by RACE technique , Real - time PCR technique , integral in situ hybridization technique , immunofluorescence technique and RNA interference technique . ( 3 ) The full length of the cDNA of the Djakt gene was cloned , the maximum open reading frame ( ORF ) was 1758 bp , and a protein composed of 585 amino acid residues was encoded . The results showed that : 1 ) The Djflotillins gene was related to the regeneration of the worm , but did not participate in the function maintenance and regeneration of the central nervous system .
【学位授予单位】：河南师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78
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本文编号：1900164