东南景天镉解毒相关代谢过程及关键基因克隆

发布时间：2018-05-17 06:40

本文选题：东南景天 + 镉超积累　；参考：《浙江大学》2017年博士论文

【摘要】：重金属污染的植物修复技术是一项具有广阔应用前景的新兴技术,在土壤重金属污染治理中具有极大的潜在价值。东南景天(Sedum alfredii Hance)是在我国本土发现的锌/镉超积累植物,研究显示有较好的潜力和应用前景。本研究以超积累生态型东南景天(HE)为材料,以非超积累生态型东南景天(NHE)为对照,采用营养液培养法,运用实时定量PCR技术、HPLC技术、激光共聚焦技术和ICP-MS等,研究了甘氨酸甜菜碱(GB,以下简称甜菜碱)和硫代谢在东南景天镉耐性和积累中的作用,取得的主要研究结果如下:1.采取水培试验探索了甜菜碱与东南景天镉耐性和积累的关系。试验结果表明:外源甜菜碱能促进镉胁迫下东南景天的生长,在HE中,400μM镉处理时东南景天叶片出现部分失绿现象,外源甜菜碱使植株叶片一定程度上复绿;在NHE中,20μM镉处理使植株出现倒伏、叶片脱落,外源甜菜碱能使镉胁迫下的植物保持正常生长,并且显著增加植株地上部生物量。外源甜菜碱能普遍增加东南景天植株体内镉含量,在HE中,在10、20、100、400μM 4个镉处理水平下,外源甜菜碱使植株地上部镉含量分别增加了16.8%、33.2%、6.3%和119.9%,根部镉含量分别增加了161.9%、17.6%、2.7%和58.6%;在NHE中,在2、10、20μM 3个镉处理浓度下,外源甜菜碱使植株地上部镉含量分别增加了6.3%、62.3%和128.3%,根部镉含量则分别减少了5.5%和增加了7.8%和61.3%。两种生态型东南景天叶片甜菜碱含量随着镉处理浓度的增加而表现出增加的趋势,在400μM镉处理时,超积累生态型东南景天叶片中甜菜碱含量是对照叶片中甜菜碱含量的6.2倍,非超积累生态型东南景天在20μM镉处理时叶片甜菜碱含量是对照叶片中甜菜碱含量的1.8倍。对比两种生态型东南景天甜菜碱含量,在20μ镉处理时HE的甜菜碱含量是NHE的2倍。外源甜菜碱能显著提高植株叶片的甜菜碱含量,所有东南景天处理叶片甜菜碱含量均显著增加。这些结果表明,甜菜碱是东南景天应对镉胁迫的一种应答机制,但是内源产生的甜菜碱不足,而外源甜菜碱能显著增强东南景天的镉耐性并增加东南景天对镉的积累。2.利用水培试验,对镉胁迫下东南景天甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因表达和酶活性在镉处理后的变化、外源甜菜碱对东南景天抗氧化酶和转运子基因表达、外源甜菜碱对东南景天氧化物含量和镉在茎中的分布进行了研究。试验结果表明:HE在镉胁迫下叶片BADH活性增强,BADH基因表达在高浓度镉处理时显著增强;在NHE中,叶片BADH活性只在镉处理后短时间内增强,BADH基因表达未受到镉处理的影响。HE叶片两种SOD基因在20μM镉处理及甜菜碱处理时表达量均无明显变化,而CAT基因表达受到镉和甜菜碱的显著上调;在NHE中,外源甜菜碱能增强两种SOD和CAT基因表达,同时又能降低镉处理后这些抗氧化酶基因的上调程度。甜菜碱处理能显著增加镉处理时东南景天叶片金属离子ATP酶2(HMA2)的表达量,而对金属耐性蛋白(MTP1)基因表达无显著影响。外源甜菜碱能显著降低两种生态型东南景天叶片中因镉胁迫产生的MDA、过氧化氢(H2O2)和超氧阴离子(O2-)。外源甜菜碱处理还使两种生态型东南景天茎中的镉分布发生变化,镉都有向中柱集中的趋势。这些研究结果表明,外源甜菜碱通过提高植物抗氧化能力和促使镉规律分布来增强植株镉耐性,通过提高镉转运子表达量来增加植株镉积累量。3.利用Genebank中其他物种的硫代谢酶氨基酸序列,在线设计合成了硫代谢几个关键酶基因的兼并引物,克隆了以上基因的片段,利用实时定量PCR技术研究了镉对东南景天5个硫代谢酶和硫腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)、烟酰胺合成酶(NAS)基因表达的影响,结果表明:ATPS、PCS、NAS三个基因对镉处理有较为明显的响应,而且在HE中均较NHE明显,在超积累东南景天中,PCS在镉处理浓度为400μM时表达量比其他处理都高,但在10、100μ时变化不明显。NAS在HE中,从镉处理24 h后根部表达量开始上升,到镉处理8天后地上部和根部表达量都显著上升,在100μM镉处理8天的根系中,NAS基因表达量是对照的19.5倍;在NHE中,叶片NAS基因在镉处理后表达量也显著上升,但是根部却显著降低。NAS基因表达在东南景天的地上部和根部差异巨大,根部表达量显著高于地上部;在HE中,100μM镉处理8天后,根部NAS基因表达量显著增加达到地上部的3171倍,NHE中最大差异是45.3倍。在10μM镉处理下,HE根部NAS表达量是NHE根部的141倍,但是两种生态型地上部NAS基因表达差异不大。这些研究结果表明,HE能在镉处理时激活硫代谢酶基因表达,植物螯合肽(PCs)并非低浓度镉处理时东南景天的主要解毒手段,NA在东南景天镉超积累中有重要作用。4.利用水培条件,测定了10μM镉处理8天时两种生态型东南景天体内硫含量,含硫的游离氨基酸含量和谷胱甘肽含量。结果表明:HE地上部和根部硫含量比对照分别增加了36.7%和32.6%;但是在NHE中没有显著差异。HE根部和地上部半胱氨酸(Cys)含量在镉处理后都出现增加,在根部比对照增加了46%,达到显著水平;而在NHE中,地上部Cys含量在镉处理后少量增加,而根部则显著降低,比对照降低了78%。超积累东南景天地上部Cys含量高于根部,而非超积累根部高于地上部。甲硫氨酸(Met)变化趋势与Cys相似,但超积累体内Met含量高于非超积累东南景天。HE根部Met含量在镉处理后最大增加了8.4倍。镉处理后,两种生态型东南景天谷胱甘肽含量都显著增加,在HE中,增加的主要形式为还原型谷胱甘肽(GSH),地上部和根部GSH含量比对照分别增加了32%和142%,而氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量变化不大;而在NHE中,GSSG含量显著增加,地上部和根部GSSG含量比对照分别增加了38%和84%,而GSH含量变化不大。在两种生态型东南景天中,地上部和根部GSH含量都高于GSSG,而且总的谷胱甘肽含量在根部高于地上部。这些结果表明,HE在镉处理时会同化更多的硫并合成更多的含硫化合物以应对镉胁迫。
[Abstract]:The results showed that the content of Cd in the plant was increased by 16.3 % , 62.3 % , 63.3 % and 58.6 % , respectively . The content of Cd in the leaves of Sedum alfredii was increased by 16.3 % , 62.3 % , 63.3 % and 58.6 % respectively . The results showed that betaine could increase the content of betaine and increase the content of BADH gene . The results showed that the content of methionine ( Met ) increased by 36 . 7 % and 32 . 6 % than CK .
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q943.2;X173

【参考文献】