禽网状内皮组织增生病病毒转录组学及免疫抑制机理的研究

发布时间：2018-05-20 06:10

本文选题：禽网状内皮组织增生病病毒 + 转录组学　；参考：《扬州大学》2016年博士论文

【摘要】：禽网状内皮组织增生病(Reticuloendotheliosis)是由禽网状内皮组织增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus)引起的一系列家禽疾病的总称。禽网状内皮组织增生病病毒为反转录病毒科禽类C型反转录病毒,感染后主要引起感染家禽免疫功能抑制和慢性肿瘤,该病的控制对养禽业的健康发展和生物制品质量的提高具有重大影响。家禽感染REV后所产生的免疫抑制现象是该病对禽类养殖造成损失的重要原因,造成这一结果的主要机制有对宿主免疫器官造成实质性的损伤,干扰免疫细胞的活化和增殖,以及抑制固有免疫细胞的活性。但是,关于病毒与宿主细胞之间的分子互作机制和致病机理,目前仍不十分清楚。本研究以REV HA1101毒株为研究对象,并应用基因芯片分析了感染鸡胚成纤维细胞的差异表达基因,并以此为基础观察了病毒感染不同宿主细胞后的形态学改变、生物化学改变、相关免疫基因的变化及可能的调控机制,为解答REV感染宿主的免疫抑制和致病机理提供了重要数据和线索。1.多重实时荧光PCR检测REV方法的建立本研究根据发表的禽网状内皮组织增生症病毒(REV)基因序列,分别针对gag、env以及LTR基因的保守序列设计了三对引物,利用重组质粒作为模板,建立了三种不同基因的标准曲线。建立的多重实时荧光PCR检测REV方法在标准品模板为108拷贝/μ1～101拷贝／μl范围内与CT值之间呈现良好的线性关系,且最低检出量为101拷贝／μl。研究结果显示,REV感染CEF后gag、env以及LTR基因的拷贝数均呈现先减少后增多的变化过程。该研究不仅为REV的诊断技术提供了一种新的方法,同时也为深入研究REV的感染机制和致病机理奠定了基础。2.REV感染宿主细胞CEF的转录组学的研究本研究旨在了解该病毒与宿主之间的相互作用关系,利用基因表达谱芯片技术以及荧光PCR方法,在不同时间点对病毒感染宿主细胞的转录水平进行监测。结果表明,病毒感染1d、3d、5d以及7d四个时间点共鉴定出1785个差异表达基因,其中参与免疫反应的相关基因在病毒感染后期呈现显著的差异性变化。进一步分析发现,差异基因主要参与信号传导、免疫反应、自噬作用以及细胞粘附作用等,其中相关信号通路有MAPK信号通路、JAK/STAT信号通路以及Toll样受体信号通路等。在众多差异基因中,IL-6、STAT-1、Myd-88、 TLRs、NF-κB、IRFs以及ISGs等在病毒感染过程中可能发挥着更为重要的作用,但其相关机制还需进一步研究。本研究首次对REV感染宿主的转录组学进行研究,从而为该病毒的致病机理以及先天免疫途径等奠定了基础。3.不同细胞中REV增殖效力研究REV的流行病学以及分子生物学研究已取得了一定的进展,但是目前用于REV的细胞培养体系只限于鸡成纤维细胞,而REV的靶向为免疫实质器官,这就限制了对REV的深刻认识。本研究选取鸡成纤维细胞系DF1、鸡巨噬细胞系HD11、鸡T淋巴细胞系MSB1 以及鸡B淋巴细胞系进行病毒感染实验。通过建立的方法对病毒感染水平检Real-timePCR测。研究发现,感染后REV拷贝数在不同的细胞系中均呈现渐进增加趋势;病毒在成纤维细胞系中的复制效率区别于免疫细胞系中的复制效率。间接免疫荧光实验可观察到病毒感染DF1细胞后在96h可见明显阳性反应,而这三种免疫细胞系在HD11、MSB1、DT4048h前均可见阳性反应。此外,显微镜下观察免疫细胞系与成纤维细胞系在形态学上存在一定区别,主要反应在免疫细胞在感染后期出现细胞碎片增多,细胞密度降低、体积缩小、折光性减弱等现象。本研究首次进行REV体外感染免疫细胞,提供了相应的感染条件和规律,为进一步研究和完善相关机制奠定了基础。4.REV感染引起免疫细胞凋亡的机理研究REV感染引起宿主细胞凋亡并造成免疫器官的实质性损伤,该损伤与免疫细胞的凋亡有关。本研究利用REV分别感染DF1细胞、HD11细胞、细胞、以及DT40细胞等MSB1不同细胞系后,利用CCK-8法检测细胞生长活力,然后通过荧光染色法和TUNELV/PI流式细胞术观察REV对免疫细胞的凋亡影响,并利用Annexin检测凋亡相关信Real-time PCR号分子9的表达,结果显示,REV感染后的免疫细胞生长活力显著低于正Caspase-3、8、常培养细胞,且随着病毒感染量及培养时间的增加,对免疫细胞生长抑制作用也显著增加；TUNEL检测方法标记感染后的免疫细胞,激光共聚焦对其扫描观察发现,感染后凋亡细胞出现红色的阳性深染现象,而正常细胞未被染色；此外出现核染不规则、核浓缩等明显的凋亡特征；利用Real-time PCR方法对Caspase-3、8、9等信号分子表达进行检测,REV感染免疫细胞后凋亡相关分子的nRNA表达水平显著升高,其中Caspase-3活性显著提高。本研究首次体外发现REV能够诱导多种类型免疫细胞发生凋亡现象,为进一步研究REV感染后细胞凋亡通路提供参考依据,同时诠释了REV所引起的免疫抑制现象。5.REV感染抑制天然免疫机理研究免疫识别与调节的分子机制是当今免疫学研究的重要领域。天然免疫系统是机体抗病毒入侵的“第一道防线”,其中模式识别受体(Pattern recognition receptors, PRRs)通过识别表达在病毒、细菌和真菌组成物上广谱的病原体相关分子模式,启动宿主抗感染的天然免疫反应。为了进一步了解REV感染不同宿主细胞对先天免疫的影响,本研究选择不同时间点,利用REV分别感染DF1细胞、HD11细胞、MSB1细胞、以及DT40细胞,并对PRRs以及下游通路的相关细胞因子的基因表达变化进行监测。研究发现,感染DF1细胞后,基因表达变化与前期实验中REV感染CEF情况一致；而HD11、MSB1、DT40三种免疫细胞系的PRRs基因表达变化呈现整体的下调现象,其中以TLR-3以及MDA5的变化最为显著,同时下游相关细胞因子的表达水平也出现下调。以配体LPS和ploy(I:C)激活相应通路信号后,再进行REV感染实验,这三种免疫细胞的PRRs以及下游通路的相关细胞因子激活可抑制病毒感染,提示REV对免疫细胞的先天免疫有着抑制调控作用,宿主机体的先天免疫作用被损害及缺失是一个重要威胁关键点。该研究结果对明确REV免疫抑制机理具有重要理论和现实意义。
[Abstract]:Avian reticuloendotheliosis virus ( REV ) was used as template to detect the immune function and the pathogenesis of REV infection . In this study , we used the method of CCK - 8 to detect the apoptosis of immune cells . The results showed that the growth of immune cells after REV infection was significantly lower than that of positive Caspase - 3 , 8 , and the growth of immune cells was significantly increased with the increase of the amount of virus infection and the time of culture .
TUNEL assay was used to mark immune cells after infection , and laser confocal microscopy revealed that apoptotic cells appeared red positive staining after infection , while normal cells were not stained .
In addition , there were obvious apoptotic characteristics , such as irregular nuclear staining , nuclear concentration and so on .
In order to further understand the effect of REV infection on the apoptosis of different host cells , the mechanism of immune recognition and regulation is the first defense line . In order to further study the effect of REV infection on the apoptosis of cells in different host cells , this study selects different time points , and uses REV to infect DF1 cells , HD11 cells , MSB1 cells , and DT40 cells .
The changes of PRRs gene expression of three kinds of immune cell lines of HD11 , MSB1 and DT40 showed that the changes of TLR - 3 and MDA5 were the most significant , and the expression level of downstream related cytokines was downregulated .
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65

【参考文献】