减数分裂相关蛋白p-CDK2和C30F12.4在配子发生中的作用及其机制

发布时间：2018-05-25 20:31

本文选题：减数分裂 + p-CDK2　；参考：《中国科学技术大学》2016年博士论文

【摘要】：随着工业化程度的提高、环境污染的加剧和生活工作压力的加大,不孕不育正在越来越严重的困扰众多的家庭,并已然成为了人类社会面临的一个重要问题。值得注意的是,不育症发病的概率正在呈现逐年上升趋势,在适龄人群中估计占15%,并且其中男性方面的因素占到了一半左右。而且在男性不育症患者中,高达60-75%的患者其发病机制不明,这就为男性不育的治疗带来了很多的困惑。因此,明确男性不育发生的原因和分子机制迫在眉睫。精子发生是一个复杂而又精确的生殖细胞分化的过程,它经历了精原细胞有丝分裂、精母细胞减数分裂和精子细胞的变形3个关键的阶段并最终形成了成熟的有功能的精子。减数分裂Ⅰ期是一个相当特殊的过程,在精子发生过程中发挥着重要的作用,减数分裂进程一旦出错精子发生就会停滞并最终导致不育。减数分裂进程中,同源染色体的配对、联会和同源染色体重组是其关键事件。在正常的减数分裂过程中,哺乳动物的X染色体和Y染色体却只有在部分区域保持有同源性,只能这个局部区域配对,而在大部分区域保持不联会,这种不联会事件会触发性染色体相关基因在减数分裂粗线期阶段表达沉默,也被称之为减数分裂性染色体沉默(meiotic sex chromosome inactivation, MSCI), MSCI保证了减数分裂的顺利进行,对于雄性动物生育有着非常重要不可或缺的作用,MSCI的异常会导致精子发生停滞在粗线期这个阶段。CDK2作为重要的细胞周期调控的蛋白激酶,在哺乳动物减数分裂过程的同源染色体行为中同样扮演至关重要的角色,特别是在同源染色体的重组和配对以及sex body形成中起关键作用。但是就磷酸化CDK2 (p-CDK2)而言,特别是第160位点的苏氨酸磷酸化的CDK2 (p-CDK239)是否在减数分裂中的发挥重要的功能至今未见有相关文献报道。我们研究发现,p-CDK2能高度特异的定位到未配对的常染色体和sex body,并且能和参与MSCI功能的关键蛋白γ-H2AX相互作用,并且这种相互作用是依赖苏氨酸160磷酸化位点的,定点突变Thr 160会干扰两蛋白的相互作用,同时我们发现,在CDK2的两个亚型中,只有亚型1(CDK239)能特异的和γ-H2AX相互作用,并且我们实验也推断出只有CDK239定位在sex body。同时我们发现,在下调磷酸化CDK2在sex body的水平后,MSCI异常,性染色体基因活化,提示p-CDK2会参与MSCI。霍尔丹法则法则指出：当两种异种生物相互交配时所产生的杂种一代中有某一个性别的个体不能够成活或不育的话,那一定这两种生物一定是异配的性别(heterogametic sex)。无论在动物或者植物中,杂交不育都广泛存在,并且这也是配子结合后生殖隔离的重要机制。在杂交不育小鼠中,通常表现出雄性不育,伴随有精子发生异常,导致精子数目下降或者精子畸形。尽管由精子发生遭到破坏导致的生殖隔离现象已经广为人知,但是其潜在的遗传机制和分子基础依然不得而知。其中一个驱动杂交雄性不育形成的假说被称之为“减数分裂驱动力”。在研究中我们发现,当我们使用不同品系的两种小鼠(PWK/Ph and C57BL/6J)进行交配时,后代的可育性明显不同。如果将PWK小鼠作为母本,F1代的雄鼠是不育的：如果将C57的小鼠作为母本,Fl代的雄鼠是可育的。并且我们在研究中发现,这个杂交后不育的Fl代雄性小鼠精子发生会停滞在粗线期精母细胞中期,而且还伴随着很多的生殖细胞出现凋亡现象。而且,不育小鼠出现了很多的减数分裂事件异常现象,如同源染色体联会异常、性染色体配对异常、常染色体和性染色体间的行为异常等等。因为减数分裂过程需要众多蛋白的参与,所以为了确定造成杂交雄性不育的蛋白分子机制,我们通过密度梯度方法分离出了杂交不育F1和杂交可育F1代的粗线期精母细胞,提取其中的蛋白进行二维电泳检测两者之间差异表达的蛋白,来确定这些蛋白是如何协同调节杂交不育过程的。分析质谱结果我们发现,在总共4005个检测到得蛋白中,有215个蛋白表达是上调的,381个蛋白表达是下调的。通过对蛋白质组学的生物信息学分析,我们发现43个蛋白对减数分裂过程非常重要,59个蛋白对精子发生过程至关重要。并且通过生物信息学分析,我们发现这些蛋白之间可能存在潜在的直接相互作用和相互调节的关系。通过分析杂交不育小鼠的粗线期细胞蛋白质组,对于我们了解杂交雄性不育和减数分裂过程有一定的指导意义。生殖、脂肪代谢和寿命是相互联系的,众多研究表明生殖过程能够影响脂肪代谢和寿命。在许多物种中,剔除生殖系统能够增加脂肪储存并导致体重增加。在线虫中,来源于生殖系统的信号能够调节寿命长短,去除生殖细胞后会改变脂肪代谢并且会显著延长寿命。近期在线虫的研究中,提供了许多直接的分子证据表明生殖、脂肪代谢和寿命是直接相关的。我们在线虫中发现一个神奇的基因,c30fl2.4,能够协同调节生殖过程、脂肪代谢和寿命。首先我们使用RNA干扰,敲低c30ff2.4后,线虫生殖力下降。通过CRISPR/Cas9技术敲除c30f12.4,我们发现线虫卵子发生受到干扰,细线期和偶线期过渡区域在线虫生殖腺中消失,导致线虫后代数目减少。其次,除了生殖力下降外,线虫的寿命也会受到影响,表现出寿命降低,易衰老。同时,在突变的线虫,脂肪代谢也会发生变化,脂肪储存下降,脂肪颗粒变小。为了确定c30f12.4编码的蛋白的定位,我们构建了GFP-C30F12.4融合蛋白的DNA融合序列,并将此序列插入到线虫染色体中,我们发现GFP-C30F12.4能够正常表达,并且清晰的定位在生殖细胞和早期胚胎中。为了确定其分子机制,我们使用转基因线虫进行免疫共沉淀,并且进行质谱分析,发现C30F12.4能够与许多蛋白发生直接相互作用,C30F12.4可能就是通过与这些蛋白的相互作用而最终将生殖发育、脂肪代谢和寿命联系在一起的。综上所示,本文报道了p-CDK2在减数分裂性染色体沉默中的重要作用,对于了解性染色体行为和基因表达以及性染色体对于正常的减数分裂和精子发生过程的作用有重要的指导意义；同时本文报道了杂交雄性不育小鼠粗线期蛋白谱表达差异情况,分析了减数分裂和精子发生中重要的蛋白之间可能存在的相互关系,对于导致杂交雄性不育的基础的分子机制探究方面有着重要的作用；最后本文还报道了蛋白C30F12.4在调节线虫生殖发育、脂肪代谢和寿命中发挥的重要作用,更深入的了解了生殖、脂肪代谢和寿命之间的相互关系。
[Abstract]:In the course of meiosis , the X chromosome and Y chromosome of mammals play an important role in the process of meiosis . It is suggested that when two different organisms mate with each other , a sex - specific individual is not able to live or infertility , which must be heterogametic sex . In this study , we found that there may be potential direct interactions between male and female sterile mice . In the study , we found that there may be potential direct interactions between male and female sterile mice . In order to determine the molecular mechanism , we have constructed a DNA fusion sequence of GFP - C30F12 . 4 fusion protein . In order to determine the molecular mechanism , we have constructed the GFP - C30F12 . 4 fusion protein . In order to determine the molecular mechanism , we have constructed the GFP - C30F12 . 4 fusion protein .
At the same time , this paper reports the difference of the expression of the crude protein spectrum of hybrid male sterile mice , analyses the possible interrelations between the meiosis and the important proteins in the spersons , and plays an important role in the research of molecular mechanism which leads to the foundation of hybrid male infertility .
In the end , this paper also reports the important role of protein C30F12 in regulating the reproductive development , fat metabolism and longevity of nematode , and has a deeper understanding of the correlation between reproduction , fat metabolism and life .
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q132.1

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