利用谷氨酸棒杆菌中血红素合成途径积累5-氨基乙酰丙酸的研究

发布时间：2018-06-10 15:59

  本文选题：5-氨基乙酰丙酸 + 谷氨酸棒杆菌　； 参考：《山东大学》2016年博士论文

【摘要】：5-氨基乙酰丙酸(5-Aminolevulinate, ALA),是一种非蛋白质氨基酸,同时也是吡咯化合物如卟啉、血红素、维生素B12、叶绿素等合成的重要中间物质,并且普遍存在于细菌、真菌、植物和动物中。ALA作为一种光动力化学试剂广泛应用于医学领域和农业领域。在医学领域,ALA作为一种光动力化学试剂广泛的用于肠胃科、泌尿科和皮肤科等,同时还作为一种光敏剂应用于各种癌症的光动力诊断和光动力治疗。在农业领域,低浓度的ALA能提高植物的抗寒性和耐盐性,还能作为一种容易降解的具有选择性的除草剂和杀虫剂。目前,ALA主要通过化学法合成,但是化学法合成步骤繁琐、分离提纯难、产量低,并且污染环境。随着生物科学技术的发展,研究者们开始集中于利用微生物细胞工厂来合成ALA,利用微生物发酵生产ALA的方法环保、安全、节能并且是可持续的,这可能是生产ALA的未来的发展趋势。许多研究利用红假单胞菌或大肠杆菌的代谢工程以及基因工程等技术来生产ALA,并且大部分研究集中于ALA的C4合成途径。但是,在C4途径的工艺研究中需要添加前体物质琥珀酸和甘氨酸,而这两种物质也是通过化学合成法制备的,从而使生物转化ALA的生产成本较高。另外,如果甘氨酸的浓度高于1.7g/L,会对菌体的生长产生抑制作用,从而使生物转化工艺变得比较复杂。在这些工艺研究中所用的培养基为昂贵的LB培养基,这也成为ALA生物转化工业化的瓶颈。目前,有研究利用大肠杆菌的C5途径来合成ALA,并且ALA产量能达到4.13g/L。C5途径与C4途径相比,具有可以直接利用廉价的葡萄糖进行代谢来合成ALA的优势。但是大肠杆菌只是模式菌株,并不是安全菌株,同时,ALA的C5合成途径的前体是谷氨酸,如果采用能大量分泌谷氨酸并且具有食品安全性的菌株谷氨酸棒杆菌的话,直接以葡萄糖作为碳源,不仅能降低生产成本,还能简化发酵工艺途径。谷氨酸棒杆菌(Corynebaererium glutamicum)是从土壤中分离得到的革兰氏阳性菌,被广泛的用于大规模工业化生产谷氨酸和其它氨基酸,最近也有研究报道被用来生产一些其它具有应用价值的有机酸、胺类和生物能源等。由于谷氨酸棒杆菌在工业生物技术中的重要性,被作为一种模式菌株用于研究原核生物的代谢与调控,同时还作为一种工具用于合成生物学的研究。因为ALA的C5合成途径的前体是谷氨酸,而谷氨酸棒杆菌不仅能天然分泌谷氨酸,还是一株食品安全菌株,所以我们考虑以谷氨酸棒杆菌作为宿主菌用于积累ALA,这对进一步开发ALA的医药价值具有一定的积极作用。含有铁离子的四吡咯化合物血红素(he me)作为许多酶的辅助因子起重要的作用,尤其是作为参与电子传递链的细胞色素氧化酶的辅助因子。尽管he me的合成在呼吸产能的过程中起重要的作用,但是he me合成过量会对菌体产生一定的毒性。以ALA作为前体的he me合成途径在许多生物体内是高度保守的。但是,在不同的生物体内,ALA的合成可能在不同程度上会受到he me的反馈抑制。在谷氨酸棒杆菌中,通过生物信息学分析了以谷氨酸作为前体合成ALA的3个关键基因gltX、hemA和hemL,主要进行了3个基因的氨基酸序列比对并找出了它们的功能结构域。通过与大肠杆菌中GluRS、HemA和HemL氨基酸序列的分析比较得出,它们的同源性分别为31.53%、25.32%和47.05%,所以需要进一步对谷氨酸棒杆菌中的gltX、hemA和hemL进行功能验证。在本研究中,我们首先从谷氨酸棒杆菌的基因组中分离得到了he me合成途径中用于合成ALA的三个关键基因gltX、hemA和hemL,然后通过氨基酸序列比对、互补实验及发酵实验验证了这三个基因。结果表明,这三个关键基因gltX、hemA和hemL分别用来编码谷氨酰-tRNA合成酶、谷氨酰tRNA还原酶和谷氨酰-1-半醛氨基转移酶。在谷氨酸棒杆菌中进行发酵实验时发现,与对照相比,过表达gltX和hemL并没有提高ALA的积累。但是,在过表达hemA后,ALA的积累明显地提高,推测将谷氨酰tRNA催化还原为谷氨酰-1-半醛的谷氨酰tRNA还原酶HemA的反应有可能是限速反应。在谷氨酸棒杆菌中协同表达内源的hemA和hemL后,ALA的积累进一步提高,初步表明谷氨酸棒杆菌具有研究和生产ALA的潜力。为了进一步提高ALA的积累,协同表达不同其它来源的hemA和hemL。实验结果表明,来源于亚利桑那沙门氏菌的突变基因hemAM在谷氨酸棒杆菌中的酶活性比较高,在与来源于大肠杆菌中的hemL共表达后明显的提高了ALA的产量。而低产量的乳酸和乙酸对ALA的生产有一定的积极作用。为了分析影响ALA积累的因素,我们在基因表达水平上进行了转录组分析。转录组数据分析表明,影响ALA合成的关键因素可能是溶氧水平和Fe2+浓度。为了解决这一问题,对Fe2+浓度和溶氧水平进行了优化,并且发现随着Fe2+浓度和溶氧水平的降低,ALA的积累不断的提高。另外,为了降低下游he me途径的合成,我们首次添加了除乙酰丙酸以外的其它各种抑制剂,并在he me合成途径的关键基因hemB的末端添加弱化标签。结果表明,在一定程度上抑制ALA的下游合成途径会影响菌体的生理代谢,并能促进ALA的积累,而通过摇瓶发酵使ALA的积累达到1.79g/L。虽然在谷氨酸棒杆菌中共表达不同来源的hemA和hemL能有效的提高ALA的积累,但是ALA的积累对菌体的代谢及生长产生了一些影响。较低的生长速率和葡萄糖消耗速率可能就是因为卟啉化合物以及he me的积累达到一定浓度后引起的。为了进一步了解这些影响和变化,进行了转录组测序的分析与比较。转录组数据分析的结果显示,在共表达不同来源的hemA和hemL后,糖酵解途径下调,而TCA循环、PPP途径和呼吸代谢途径是上调的。推测糖酵解途径下调后使代谢流流向产生NADPH的PPP途径,从而使NADPH的积累提高,然后参与需要以NADPH作为辅助因子的HemA的催化合成。同时,呼吸速率的提高可能会促进TCA循环的提高,而TCA循环提高后,会降低代谢溢流如乙酸的合成。而呼吸速率和TCA循环的提高会促进电子传递链的电子传递和能量产生。另外,几个参与he me合成途径的基因的表达量发生了上调,同时,编码双组份系统HrrSA的两个基因的表达量也上调,结果表明双组份系统HrrSA的表达量提高后可能用于调控上调的he me合成途径,并且间接表明he me进行了积累并影响了细胞内的生理代谢。另外,结合文献报道以及根据转录组数据对he me下游合成途径的分析,推测he me下游的合成途径的调控是比较复杂的,并且可能是影响ALA积累的关键因素。总之,在谷氨酸棒杆菌中过表达外源的hemA和hemL对菌体的基本代谢途径产生了一定的影响,通过转录组数据分析,我们不仅了解ALA的积累对菌体所产生的代谢途径的影响与调控,同时还为进一步提高ALA的积累提供了理论指导。既然在共表达不同来源的hemA和hemL后,双组份系统能参与he me合成途径的调控,我们进一步研究分析了谷氨酸棒杆菌中的双组份系统。虽然he me不仅是参与呼吸代谢途径的细胞色素氧化酶的辅助因子,同时也是参与某些中心代谢途径的酶的辅助因子。但是,如果heme的浓度超过一定阈值会对菌体产生一定的毒性。在谷氨酸棒杆菌中,双组份系统HrrS A和ChrSA在heme的平衡中起重要的调控作用。当heme存在并达到一定浓度时,HrrSA会调控heme的降解以及以heme作为辅助因子的细胞色素氧化酶的合成,用来降低heme的合成,而ChrSA主要是激活转运蛋白基因hrtBA的表达,将heme转运到细胞外。为了降低细胞内所产生的heme对菌体自身所产生的影响,我们过表达了内源基因hmuO和hrtBA,并且在添加抑制剂后,ALA的积累达到1000 mg／L左右,更重要的是,该重组菌株的生长速率和葡萄糖消耗也有所提高。本论文首次通过谷氨酸棒杆菌的heme合成途径来提高ALA的积累。我们首先克隆得到参与heme合成途径的关键基因gltX、hemA和hemL,并进行了序列与功能验证。共表达不同来源的hemA和hemL虽然提高了ALA的积累,但是出现了生长速率和葡萄糖消耗速率慢等现象,所以我们通过转录组分析找出了影响ALA积累的关键影响因素溶氧水平和Fe2+浓度,然后进行了优化并进一步提高了ALA的积累。通过添加包括乙酰丙酸在内的各种ALAD抑制剂,或者在ALAD的C端添加弱化标签,使得ALA积累达到1.79g/L。发酵条件优化后,虽然ALA的积累提高了,但是对菌体的生长和代谢依然有一定的影响,所以又在转录组水平上与对照菌株进行了系统的分析与比较。最后,利用谷氨酸棒杆菌中的双组份系统又在一定程度上提高了ALA的积累,并且还提高了菌体的生长速率和葡萄糖消耗速率。
[Abstract]:5 - Aminolevulinate ( ALA ) , a non - protein amino acid , is an important intermediate substance synthesized by pyrrole compounds such as porphyrin , hemin , vitamin B12 , chlorophyll , etc . In this study , three key genes gltX , hemA and hemL were isolated from the genome of Corynebacterium glutamicum . The results showed that the three key genes gltX , hemA and hemL were used to synthesize ALA . In order to improve the accumulation of ALA , it was found that the accumulation of ALA increased with the increase of the concentration of Fe 2 + and hemL . The results showed that the accumulation of ALA increased with the increase of the concentration of Fe 2 + and hemL . In order to decrease the accumulation of ALA , the growth rate of ALA and the rate of glucose consumption have been improved .
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q936
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本文编号：2003782